ایمونولوژیک ،آنتی ژن سطحی سلولی، بروسلا محسوب میشود و میتوان از شاخص های دیگر آنتی ژنی دیواره سلولی بروسلا ،برای مثال پروتئین های غشای خارجی (Omp) و لیپوپلی ساکارید به عنوان ایمونوژن در ساخت واکسن های زیر واحدی استفاده نمود.بدلیل اینکه بروسلا فاقد پیلی،فلاژن وکپسول می باشد، بیشترین میزان پاسخ های سیستم ایمنی را ایجاد میکند(19،1،3،12).در این راستا، تولید واکسن کونژوگه ی بروسلا، باتوجه به معایب واکسن های قبلی وفواید این تحقیق، ما را به تهیه واکسن کنژوگه ی زیر واحد ی مناسب و جدید، برای ریشه کنی و پیشگیری بروسلوز در دام و انسان سوق می دهد.
هدف از تحقیق:
اهداف جزئی این تحقیق شامل:
تهیه و تخلیص LPS بروسلا آبورتوس S99
تهیه و تخلیص OMP بروسلا آبورتوس RB51
تهیه کونژوگه LPS بروسلا آبورتوس S99 با OMP بروسلا آبورتوس RB51 و
بررسی ایمنی زایی همورال آن در حیوانات آزمایشگاهی
هدف کلی این تحقیق:
بررسی ایمنی زایی همورال واکسن کونژوگه LPS+Omp بروسلا آبورتوس S99 و RB51 به روش سرم باکتریوسیدال اسی(Serum Bactericidal Assay) می باشد.
.1-2بروسلا وبروسلوزیس:
بروسلا ها در انسان باکتریمی داده ومی توانند برای مدت طولانی در خون انسان باقی بمانند. بقای بروسلا در محیط های مختلف و فراورده های لبنی 1 : آب: 57-1 روز2. خاک (رطوبت 90% ) : 73-48 روز 3. کود: 205-1 روز4. مواد زائد حیوانی: 4-1 ماه 5.پشم: 110 روز.6 شیر: در صفر درجه به مدت 24 ساعت الی 18 ماه .7خامه : 6-4 هفته.8 بستنی: تا 30 روز .9کره: تا 142 روز.10 پنیر: 3 ماه.11 گوشت نمک سود یا یخ زده: 12-3 ماه.
بروسلا سبب ایجاد تب مالت یا تب مواج یا تب دانگ ویا تب مدیترانه ای در انسان می شود. بروسلا ها به طور رایج از طریق خوردن محصولات لبنی آلوده یا محصولات گوشتی آلوده به انسان انتقال می یابد.جنس بروسلا براساس تنوع آنتی ژنی ومیزبان اولیه شامل7گونه ی (بروسلاملیتنسیس) درگوسفندوبز،)بروسلاسوئیس (درخوک)،بروسلاآبورتوس (درگاو،) بروسلااویس (درگوسفند) بروسلاکانیس (درسگ)،،بروسلانئوتومه (درموش جنگلی و) بروسلاماریس (درپستانداران دریایی می باشد.بروسلا در میزبان حیوانی خود بیماری شدیدی ایجاد می کند اماعفونت آنها در انسان ملایم است معمولا.در بیماری بروسلوز انسانی(تب مواج یا تب مالت)دو مرحله وجود دارد یک مرحله حاد که بصورت باکتریمی حاد اتفاق افتاده وبه دنبال آن مرحله مزمن ایجاد می شود که ممکن است سال ها طول کشیده بافت های مختلفی را درگیر می کند.این باکتری ارگان های بسیاری را می تواند درگیر کند، از جمله، در سیستم عصبی،مننژیت ، مننگوانسفالیت و بسیاری بیماری های دیگر، در سیستم اسکلتی، اسپوندیلیت، درگیری استئوآرتیکولار در 20% تا 80% از موارد، در سیستم گوارشی، بروسلوز علائمی مشابه با تب تیفوئید دارد، درگیری کبدی ایجاد می کند، پانکراتیت وغیره نیز ایجاد می کند. در سیستم قلبی-عروق می تواندعامل اندوکاردیت در کمتر از 2% موارد بکند، اما این مقدار مرتبط با میزان موارد منجر به مرگ می باشد. در سیستم تنفسی،می تواند برونشیت، نومونیا، آبسه ،و…رخ دهد.در سیستم ادراری-تناسلی، نفریت، گلومرولونفریت، پایلونفریت، اورکیت، آبسه کلیوی، سقط جنین،و…رخ می دهد.عفونت مزمن زمانی رخ می دهد که، بیماری علی رغم درمان آنتی بیوتیکی، در ارگانی مثل طحال، کلیه، مغز استخوان، دوام پیدا کند. در این زمان، میزان IgG بالا می رود، و درمان شامل جراحی و تخلیه محل عفونت می باشد. در این شرایط، تب به صورت عودکننده دیده می شود. بروسلوز در کودکان نادر است . در همه سنین می تواند ایجاد بیماری کند. دارای قابلیت بقا یافتن و تکثیر شدن در فاگوسیت های تخصصی و غیر تخصصی می باشند، وعامل سقط جنین در دام های اهلی هستند.بروسلا آبورتوس از جمله مهم ترین عوامل سقط جنین به گاو است.دلیل ایجاد سقط جنین در گاو علاقه مندی این باکتری به الکل 3کربنه اریتریتول می باشد از آنجا که در منطقه جفت گاو است باکتری در این منطقه کلنیزه می شود.چون در انسان اریتریتول نداریم سبب سقط جنین نمی شود. رشد باکتری بر روی محیط های آزمایشگاهی کند بوده، اغلب در دمای 27 درجه سانتیگراد قبل از 48 ساعت محسوس نیست. در کشت های اولیه، بروسلا آبورتوس و بروسلا سوییس نیاز به 5 تا 10 درصدCO2دارند(کاپنوتروف).آزمایش تولیدH2Sهمراه با سایر خصوصیات برای تشخیص گونه های بروسلا مفید است.3 آنتی ژن سطحی در بروسلا شناسایی شده که 2 آنتی ژن توسط فرم S کلنی شده و یک آنتی ژن توسط فرم R کلنی تولید می شود.Ag A که به طور غالب در بروسلا آبورتوس دیده می شود.Ag M به طور غالب در ملی تنسیس دیده می شود.تشخیص قطعی بروسلوزیس علی رقم استفاده از تکنیک های کشت وسرولوژیک به عنوان یک معضل باقی مانده است. امید یه رفع این مشکل در سال های اخیر با پیشرفت تکنیک های مولکولی قوت بیشتری گرفته است.(16،17)
شکل(2-1)- عفونت دریچه قلب توسط B.abortus .
2-1-1.تاریخچه:
بروسلوز بیماری عفونی ناشی از باکتریهایی است که اکنون به احترام David Bruce، کاشف اولیه ارگانیسم از طحال سربازان انگلیسی تلف شده در جزیره مالت در سال 1887، بروسال نامیده میشوند.
در سال Almroth Wright, 1897 و همکارانش آزمایش آگلوتیناسیون سرم را توصیف نموده که در شکل اصالح شده آن به عنوان متداولترین روش برای تشخیص بروسلوز شناخته شده است.
در سال M.Louis Hughes, 1897 شرح تجارب خود را در مورد بیماری در مالت(1890 تا 1896)منتشر نموده و سیر “مواج” تب در انسان را بیان داشت.
در سال 1943،Forrest Hudleson میکروبیولوژیست دامپزشک در دانشگاه ایالت میشیگان، بروسالا ملی تنسیس را به عنوان کوکوباسیل هوازی، گرم منفی و بدون نیاز به گاز CO2 جهت جداسازی اولیه توصیف نمود.
Cotton و schooeder ضمن بررسی باسیل سل گاوی برای اولین بار بروسالاآبورتوس را از شیر گاوهای در 1911 جدارکرد.(23)
در ایران در سال 1311 از کشت خون انسان، بروسال ملی تنسیس در انستیتو پاستور ایران جداشد.در سال 1323 از جنین گاو بروسال آبورتوس در مؤسسه تحقیقاتی واکسن وسرم سازی رازی جداشد.در سال 1329 از شیر بز و گوسفند، بروسال ملی تنسیس در مؤسسه تحقیقاتی واکسن و سرم سازی رازی جدا شد.در سال 1350 بروسال سوئیس از خوک در مؤسسه تحقیقاتی واکسن و سرمسازی رازی جداشد.
2-1-2.وضعیت بیماری در ایران:
تعیین میزان شیوع بیماری تب مالت بدلیل عدم گزارش کامل موارد بیماری مشکل است ولی با وجود سیستم مراقبت، گزارشات جاری می تواند مبین روند میزان بروز واقعی بیماری باشد. با بررسی تعداد و میزان بروز بیماری در کشور، بیماری از سال 1359 لغایت 1368 رو به افزایش بوده است و از سال 1368 لغایت 1389 با شروع برنامه های اول و دوم توسعه از 170 مورد در صدهزار نفر به حدود 15/9 در صد هزار نفر رسیده است و بدنبال ارتقاء سیستم مراقبت و گزارش دهی بیماری روند نسبتاً رو به افزایش بیماری از سال 1378 لغایت1384 وجود داشته است و از سال 1385 بدنبال موفقیت در افزایش پوشش واکسیناسیون دام ها روند بیماری رو به کاهش بوده است.
ایجاد هماهنگی بین بخشی، استاندارد کردن تعاریف بیماری، آموزش جامعه و کارکنان بهداشتی، افزایش گزارش دهی، افزایش کارخانجات تولید فرآورده های لبنی پاستوریزه، افزایش پوشش واکسیناسیون دامی ازعوامل مؤثر در کنترل و پیشگیری بیماری در دام و نهایتا در انسان می باشد(18).
بیماری در تمامی سنین وجود دارد ولی وفور آن در سنین 20-30 سالگی می باشد، یعنی نیروی فعال و کارآمد کشور در معرض خطر این بیماری هستند.
بیماری در هر دو جنس دیده میشود ولی با اختالف کمی در جنس مذکر( 55/4 درصد) بیشتر از جنس مؤنث( 44/6 درصد) دیده میشود.
بیماری را نمیتوان انحصاراً یک بیماری شغلی محسوب نمود ولی شغل به عنوان یک عامل خطر در ابتال به بیماری مطرح است بخصوص نزد خانمهای خانهدار(خانم های خانه دار عمدتاً به عنوان دامدار و کشاورز دوشادوش همسرانشان در مناطق روستایی به فعالیت می پردازند)، دامداران و کشاورزان.
بیماری در تمام فصول وجود دارد اما در فصل بهار و تابستان همزمان با فصل زایش و شیردهی دامها بیشتر دیده میشود.
بیماری در منطقه روستایی(77 درصد) بیشتر از منطقه شهری (23درصد) می باشد که مرتبط با تماس با دام آلوده و استفاده از فرآورده های لبنی غیرپاستوریزه در مناطق روستایی می باشد.(18)
2-1-3.انتشار بروسلوز در جهان:
تخمین شیوع واقعی بروسلوز انسانی در جهان به علت عدم گزارش کامل بیماری در بسیاری از کشورها، غیرممکن است. این وضعیت برای هر دو گروه کشورهای پیشرفته و در حال توسعه صادق می باشد. با وجودی که بروسلوز گاوی در بسیاری از کشورهای پیشرفته ریشه کن شده یا تحت کنترل قرارگرفته، لیکن شیوع آن در بسیاری از کشورهای در حال توسعه، علیرغم پیشرفت صنایع شیر با حداقل امکانات دامپزشکی، افزایش یافته است. وضعیت مشابهی در سطح محدودتر برای بروسلوز گوسفندی، بزی و خوکی اتفاق افتاده است.با توجه به مخاطره بیشتر در دو نوع اخیر نسبت به عفونت بروسال آبورتوس برای بهداشت انسانی، در نتیجه
افزایش تعداد موارد بروسلوز انسانی در سطح جهان قابل تصور است. کشورهای عاری از بروسلوز براساس آخرین یافته ها در کشورها چنین است(18):
کشور
سال اعلام ریشه کنی
جزایر مانش
1935
نروژ
1952
سوئد
1957
فنلاند
1960
دانمارک
1962
سوئیس
1963
چک و اسلواکی
1964
رومانی
1969
اسکاتلند
1980
انگلستان و ولز
1981
هلند،اتریش،لوکزامبورگ،بلغارستان،ژاپن و قبرس
1985
جزایر فارکلند
1994
جدول(2-1)کشور های عاری از بروسلوز
2-2.اهمیت مراقبت بروسلوز ) بیماری تب مالت(:
بروسلوز(بیماری تب مالت) در انسان نشان دهنده گسترش بیماری در حیوانات است. معمولا عفونت در انسان به تماس مستقیم با حیوانات آلوده یا فرآورده های آنها وابسته است.تماس با حیوانات دچار سقط جنین و مصرف شیر آلوده یا فرآورده های آن مخاطرات اصلی می باشند.
در سطح جهانی، اکثر موارد بروسلوز انسانی در نتیجه بروسالا ملی تنسیس اتفاق افتاده که مهاجم ترین و بیماری زا ترین گونه در بین گونه های جنس بروسالا میباشد. معموالا عفونت ناشی از بروسالا آبورتوس در انسان خفیف تر بوده و بروسالا کنیس کم ترین تهاجم را از بین چهارگونه برای انسان دارد و بروسالا سوئیس بیماریزایی زیادی داشته و غالبا عوارض شدیدی چون آبسه های بافتی عمقی را موجب میگردد.
عفونت های انسانی ناشی از باکتری های بروسالا همیشه بیش از موارد مبتالا با علائم بالینی می باشد. نسبت موارد بدون علامت به بالینی بروسلوز ممکن است 8 به 1 و یا بالاتر باشد(23).
به علت عدم وجود اطلاعات کافی از وقوع بیماری در انسان وحیوانات در بسیاری از کشورها، یا بدلیل فقدان تسهیلات تشخیصی و گزارشی، تخمین دقیق از میزان شیوع بروسلوز در سطح جهانی وجود ندارد.علاوه بر این، بسیاری از موارد بروسلوز در انسان خفیف بوده یا با تظاهرات بالینی غیرمعمول همراهی شده که به درستی تشخیص داده نمی شود.
در اکثر موارد، تعریف بروسلوز حاد یا مزمن بدلیل نشانه های بالینی مختلف مطرح میشود. گاهی شواهد سرولوژی بروسلوز در افرادی بدون تاریخچه ای از علائم بیماری دیده شده، که بدلیل تولید آنتی بادی های ناشی از تماس با بروسالا و بدون ایجاد تظاهرات بالینی بوده است. بطور معمول این وضعیت در افرادی با سابقه تماس با حیوانات بیمار مشاهده میگردد. بدیهی است که علائم بالینی خفیف در چنین بیمارانی مورد توجه قرارنگیرد(23).
اکثر بیماران مبتالا به بروسلوز علائم غیراختصاصی ناراحتی سیستم عصبی، چون سردرد، رخوت،افسردگی نشان می دهند. مشخص ترین و شناخته شده ترین سندرم بروسلوز عصبی، مننژیت ب