پایان نامه ارشد درمورد سلولی، حاوی، میکنیم.

نشود.
5) با عدسی شیئی 20 برابر، میکروسکوپ را تنظیم و بر روی یکی از خانههای 16 تایی متمرکز میکنیم.
6) سلولها را به ترتیب در 4 مربع کناری شمارش میکنیم. (این کار را می توان با استفاده از شمارشگر دستی انجام داد).
7) با استفاده از محاسبات تبصره 3، غلظت سوسپانسیون سلولی را به دست میآوریم.
تبصره 1 : یک خط 3 تایی هر مربع اصلی را از یکدیگر جدا میکند. سلولهایی که خطوط مرزی فوقانی یا چپ هر مربع را در بر میگیرند به حساب میآیند اما سلولهایی که خطوط مرزی تحتانی یا راست را در بر می گیرند به حساب نمیآیند.
تبصره 2 : اگر بیش از 10 % سلولها به صورت خوشهای باشند، نمونهگیری مجددا انجام میشود.
با توجه به اینکه باید تلاش گردد سوسپانسیون، تعلیقی همگون یابد.
تبصره 3 : از آنجایی که در طی آزمایشات بررسی سمیت سلولی جاری فرض بر آن است که در هر چاهک سلولی 3000 سلول وجود داشته باشد، با توجه به محاسبات زیر نحوه تهیه چنین غلظتی به قرار زیر است:
mm2 (1 mm ×1 mm) 1 = مساحت مربع اولیه
mm 1/0= ارتفاع (عمق)
cc 4-10× 1= حجم مربع اولیه در لام نئوبار
بنابراین اگر فرضا در هر مربع اولیه n سلول شمارش شده باشد، غلظت سوسپانسیون اولیه (c1) به قرار زیر است:
4-10 n
1ml c1
حال برای آنکه در هر 100 میکرو لیتر، 3000 سلول وجود داشته باشد باید سوسپانسیونی تهیه شود که هر میلی لیتر آن حاوی 30000 سلول باشد یعنی:
c1v1=c2v2
c1v1=30000×v2
v2=c1/30000 یا v2=n×104 /30000 = n/3
v2 : حجم مورد نیاز برای تهیه رقت از سوسپانسیون سلولی اولیه
n: تعداد سلولهای شمارش شده در هر مربع
پروتکل 3- نحوه نگهداری سلولهای کشت شده در حالت انجماد
1) طبق پروتکل یک، سوسپانسیون سلولی همگونی تهیه و با استفاده از روش رنگ آمیزی میزان حیات سلولی مشخص میشود. سلول ها با غلظتی حدود 106×6 سلول زنده در هر میلی لیتر از محیط غنی از سرم (40 %) سرد شده و حاوی 10 % DMSO دوباره معلق میشود.( برای برخی از سلولها می توان به جای محیط کلا از 90 % FCS استفاده کرد).
2) در ویالهای نگهداری سلول ( که قبلا تاریخ و چگالی سلولی به همراه مشخصات سلولی بر آن نوشته شده است) 1 سی سی از این سوسپانسیون سلولی ریخته میشود. در ویالها باید به خوبی سفت شود.
3) ویالها را 15 تا 30 دقیقه بر روی یخ مرطوب قرار داده تا سلولها با محیط حاوی DMSO به تعادل برسند.
4) سلولها در این مرحله باید به مدت 3 ساعت در دستگاههای منجمد ساز ویژه قرار گیرند.(به نحوی که به ازای هر دقیقه 1 درجه به برودت محیط افزوده شود.)در صورت نبود چنین دستگاهی می توان ویالها را در فریزر 70- درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت قرار داد.
5) ویالهای منجمد شده به تانکهای ازت مایع منتقل میشوند.
پروتکل 4- نحوه ذوب کردن و استحصال سلولی از نمونههای منجمد سلولی
1) 15 میلی لیتر از محیط RPMI 1640 حاوی 10% FCS ( mg/ml 100 پنی سیلین و mg/ml 100 استرپتومایسین ) را در یک فلاسک کشت، برای مدت 2 ساعت در یک انکوباتور CO2 دار قرار داده تا به حال تعادل به محیط برسد.
2) تحت شرایط ایمنی (استفاده از دستکش عایق و عینک) ویال منجمد سلولی را از تانک ذخیره ازت خارج میکنیم.
3) زیر هود به منظور اجتناب از انفجار احتمالی ویال (به علت ورود احتمالی ازت مایع به داخل ویال) در آن را بعد از ضدعفونی کردن سطح خارجی ویال با الکل 70 درجه، شل میکنیم تا گاز ازت خارج شود.
4) در ویال را مجددا بسته و فورا در بن ماری 37 درجه سانتی گراد آن را ذوب میکنیم. فرایند ذوب شدن بایستی حدودا ظرف 1 دقیقه تمام و از حرارت بیش از حد به سلول ها اجتناب شود.
5) قطره قطره محیط به ویال افزوده و سپس محتویات آن را خارج و همراه با محیط در لولههای آزمایش استریل 15 سی سی سانتریفیوژ میکنیم. پس از سانتریفیوژ محیط رویی را خارج و سلولها را دوباره به صورت تعلیق در محیط درآورده و به فلاسک از پیش آماده حاوی محیط و FBS منتقل و انکوبه میکنیم.
پروتکل 5- بررسی سمیت سلولی مواد با استفاده از آزمون MTT
ردههای سلولی مختلف در محیط کشت RPMI 1640 که حاوی پنیسیلین ( IU/ML100)، استرپتومایسین ( IU/MI100)، گلوتامین ( mmol2) و 10 % سرم جنین گاو (FBS) بود در دمای 37 درجه سانتی گراد و در اتمسفر حاوی 5% CO2 انکوبه شدند. سلولها در فلاسکهای T شکل cm 275 در 15 میلی لیتر محیط و با اینوکلوم اولیه 106 × 2-1 سلول، شروع به رشد می کردند(بسته به نوع رده سلولی سرعت رشد متفاوت بود). بعد از گذشت سه روز و پوشیده شدن بستر فلاسک از سلول، لایه سلول چسبنده به کف فلاسک به روش آنزیمی و با استفاده از تریپسین- ورسن جدا میشود و پس از انتقال به لوله آزمایش استریل به مدت 10 دقیقه در دور 1200 سانتریفیوژ میشد.

دیدگاهتان را بنویسید