پایان نامه ارشد درمورد استان خوزستان

پرفروش در سال 2000 در سراسر دنیا، 14 ترکیب را فرآوردههای طبیعی و یا مشتقاتشان تشکیل میدهند (Cox PA. 1990) دو فرآورده گیاهی موسوم به paclitaxeltaxol ( از پوست درخت سرخدار اقیانوس آرام با نام Taxus brevifolia) و camptothecin (از گیاه زینتی چینی) تخمین زده میشود که حدوداً یک سوم از بازار دارویی ضدسرطان دنیا را به خود اختصاص دهد(Cragg GM, et al. 1997). همچنین جداسازی آلکالوئیدهای وینکا، vinblastine و vincristine از گیاه Madagascar periwinkle و Catharanthus roseus عصر جدیدی را در استفاده از مواد گیاهی به عنوان داروهای ضدسرطان معرفی کردند. آنها اولین داروهایی بودند که در پزشکی برای درمان سرطان استفاده شدند. vinblastine و vincristine در ترکیب با دیگر داروهای شیمی درمانی، برای درمان تعدادی از سرطانها مانند لوسمی لنفوم، سرطان بیضه پیشرفتهه، سرطانهای سینه استفاده میشوند .(Cragg GM, Newman DJ, 2005) Epipodophyllotoxin یک ایزومر از podophyllotoxin است که به عنوان فرآورده ضد توموری از ریشه گونههای پودوفیلوم به نام Podophyllum peltatum و podophyllum emodi جدا شد(Farnsworth NR, 1985). Etoposide و teniposide دو مشتق نیمه صنعتی از Epipodophyllotoxin هستند که در درمان لنفومها و سرطانهای برونش و بیضه استفاده میشود(Cragg GM, Newman DJ, 2005). Homoharringtonine که از درخت چینی Cephalotaxus harringtonia جدا میشود(Hartwell JL,1982; Harvey AL, 1999) . مخلوط راسمیک هارینگ تونین و هوموهارینگ تونین در چین به طور موفقیت آمیزی برای درمان لوسمی حاد میلو‍‍ژن استفاده شده است (Cragg GM, Newman DJ, 2005). Elliptinium یک مشتق از Ellipticin که از گیاه دارویی جزایر فیجی موسوم به Bleekeria vitensis بدست میآید در فرانسه برای درمان سرطان سینه استفاده میشود (Cragg GM, Newman DJ, 2005). در حال حاضر بیش از 270000 گیاه آلی در روی کره زمین وجود دارد اما فقط تعداد کمی از آنها از نظر فیتوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفتهاند. بنابراین پیشبینی میشود که گیاهان بتوانند ترکیبات زیست فعال بالقوهای را برای توسعه داروهای جدید برای مبارزه با سرطان ارائه دهند. مطالعه حاضر به منظور بررسی اثرات احتمالی سمیت سلولی عصاره گیاهی Ammi visnagaبر روی رده سلولی Hela و MCF7 صورت گرفته است.
فصل سوم
مواد و روشها
کشت سلول فرآیندی است که به وسیلهی آن سلولهای پروکاریوت و یوکاریوت تحت شرایط کنترل شده رشد میکنند.
در واقع منظور از کشت سلول،کشت سلولهای گرفته شده از یوکاریوتهای پرسلولی به خصوص سلولهای جانوری است.
3-1 مواد و وسایل مورد استفاده
3-1-1 وسایل آزمایشگاهی مورد نیاز
1) آسیاب
2) روتاری
3) بن ماری
4) فویل آلومینیومی
5) ترازوی دیجیتال 3 صفر
6) هود لامینار
7) سمپلرهای تک و هشت کاناله
8) پیپتور
9) چراغ الکلی
10) میکروسکوپ معکوس
11) انکوباتور CO2 دار
12) تانک ازت
13) اتوکلاو
14) سرنگ 5 میلی لیتر
15) فیلتر سرنگی
3-1-2 مواد شیمیایی مورد نیاز
اتانول 96 درجه، آب مقطر، آب ژاول، محیط کشت RPMI 1640 (تهیه شده از شرکت Sigma)، سرم جنین گاوی(FBS) (تهیه شده از شرکت Sigma)، پنی سیلین استرپتومایسین(PS) (تهیه شده از شرکت Sigma)، فسفات بافر سالین(PBS) (تهیه شده از شرکت Sigma)، تیریپسین (تهیه شده از شرکت Sigma)، رنگ تریپان بلو (تهیه شده از شرکت Sigma)، محیط کشت DMSO (تهیه شده از شرکت Sigma)، هپارین سدیم 5000، فایکول
3-2 جمع آوری گیاه
گیاه Ammi visnaga در اواخر بهمن ماه 1390 از منطقه دزفول در استان خوزستان جمع آوری گردید. بخشهای مختلف گیاه در سایه در مجاورت هوا خشک، سپس پودر گردیده و برای تهیه عصاره مورد استفاده قرار گرفت.
3-3 روش عصاره گیری
جهت عصارهگیری ابتدا 250 گرم از گیاه خشک مورد نظر را به صورت پودر درآورده و سپس 40 گرم از آن را به همراه حلال (اتانول 80 % ) در یک ظرف در بسته برای یک دوره حداقل سه روزه همراه با تحریک مکرر به منظور حل شدن ماده حل شونده در دمای اتاق نگهداری کردیم. مخلوط حاصل کدر بود. سپس مواد جامد مرطوب پرس شده و مایعات ترکیب شده به وسیله فیلتراسیون و یا ظرف به ظرف کردن جدا شد. حلال اتانول با استفاده از روتاری و با روش تقطیر در خلاء خارج گردید. این عصاره به عنوان عصاره خالص در نظر گرفته شد و غلظت های مختلف از آن تهیه شد.
3-4 تهیه رقتهای مختلف از عصاره گیاهی
عصاره گیاهی مورد نظر توسط ترازوی حساس دیجیتالی توزین گردید و مقدار 24 میلی گرم از آن را در 150 میکرولیتر DMSO به صورت محلول در آورده شد. سپس در محیط کشت سلولی(RPMI 1640) رقتهای مختلف مورد نیاز تهیه شد. رقتهای به کار رفته در این تحقیق شامل 156/0، 312/0، 625/0، 25/1، 5/2، 5، 5/7 و mg/ml 10 می باشند.
میزان DMSO در محلول نهایی موجود در چاهکهای کشت سلول کمتر از 1% محاسبه گردید. DMSO تا غلظت کمتر از 1% فاقد سمیت است وغلظت این حلال از این حیث مهم میباشد.
3-5 ردههای سلولی
سلولهای مورد استفاده در این تحقیق از بخش بانک سلولی انستیتو پاستور ایران به صورت فلاسک خریداری شد. سلولها در محیط کشت RPMI 1640 (خریداری شده از شرکت سیگما) کشت داده شد. محیط کشت حاوی 10 % سرم جنین گاو غیر فعال شده (FBS)، پینی سیلین ( 100 واحد در هر میلی لیتر) و استرپتومایسین ( 100 میکروگرم به ازای هر میلی لیتر) بود. ردههای سلولی مورد نظر در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد و در اتمسفر حاوی 5 % CO2 و 95 % رطوبت نگهداری گردید. مشخصات ردههای سلولی به کار گرفته در این مطالعه در جدول 3-1 آورده شده است.
جدول 3-1
مشخصات کلی سلولی
نام رده سلولی
کد بانک سلولی
رده سول های سرطانی دهانه رحم
Hela
NCBI C115
رده سلول های سرطانی پستان
MCF – 7
NCBI C135
3-6 محیط کشت
از آنجایی که همه سلولهای مورد استفاده در این آزمایش برای رشد در محیط RPMI 1640 سازگار شدهاند (بانک سلولی انستیتو پاستور ایران) جهت کشت این سلولها از این محیط استفاده شد. این محیط توسط Moore و همکارانش در Roswell Park Memorial Institue تکوین یافت (Moore G.E. 1967) و از این رو RPMI خوانده میشود. در فرمولاسیون این محیط که بر پایه سری محیطهای کشت RPMI 1630 بنا نهاده شده است از سیستم بافر کننده بیکربنات استفاده میشود و تغییراتی نیز در مقدار اسیدهای آمینه و ویتامینهای آن به وجود آمده است ( جدول 3-2). این محیط برای حمایت از رشد بسیاری از انواع کشت سلولی کاربرد دارد.
جدول 3-2 اجزای محیط کشت RPMI-1640
3-7 سرم جنین گاو (FBS)
سرم جنین گاو، با فاکتورهای رشد ضروری و گستردهای که دارد (جداول 3-3 و 3-4) یکی از ارکان رشد ردههای مختلف سلولی است. در این آزمایش به علت نیاز سلولها از محیطهای سرم دار استفاده شد. براین اساس FBS قبل از افزودن به محیط کشت سلولها، به مدت نیم ساعت در دمای 56 درجه سانتی گراد حمام بخار آب قرار داده شد تا سیستم کمپلمان آن غیرفعال شود. سپس در ظروف 10 سی سی استریل و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردید و در زمان کشت به میزان 10 % به محیط اضافه شد.
جدول 3-3 اجزای اصلی سرم (FBS)
3-8 محلول پنی سیلین استرپتومایسین
این محلول به صورت آماده از شرکت Sigma خریداری شد و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردید و به ازای 100 میلی لیتر محیط کشت 1 میلی لیتر آنتی بیوتیک اضافه شد.
3-9 تریپسین- ورسن (Gibco)
این محلول که حاوی 5/0 گرم تریپسین (1:250) و 2/0 گرم EDTA (Versen) به ازای هر لیتر از آن است به ظروف 4 میلی لیتر استریل تقسیم و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
تریپسین(1:250) : منظور فعالیت 1 گرم از این تریپسین است که قادر خواهد بود 250 گرم کازئین را تحت شرایط عنوان شده در usp برای فعالیت پروتئازی پانکراتین ( یعنی دمای 25 درجه سانتی گراد، به مدت 10 دقیقه در 6/7pH = ) هضم کند
3-10 تهیه محلول MTT (5mg/ml)
250 میلی گرم پودر MTT (خریداری شده از شرکت Sigma) به نسبت 5mg/ml در PBS حل و با صافی 22/0 میکرون استریل صاف و در ظرف در پیچ دار استریل و با پوشش آلومینیومی در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
3-11 فرآوری خون (جدا کردن سلول های تک هستهای خون محیطی)
ابتدا یک لوله فاکون تک استریل 15 سی سی تهیه و 2 سی سی فایکول را به درون آن منتقل میکنیم. سپس 3 سی سی از خون محیطی گرفته شده را قطره قطره و به آرامی به فایکول درون لوله فالکون اضافه میکنیم. سپس درب لوله فالکون را بسته و در سانتریفیوژ با دور 1500 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ میکنیم. پس از پایان 20 دقیقه بایست لایه ابری شکل متشکل از سلولهای تک هستهای را که بین 2 لایه سلولهای خونی در پایین و پلاسما در بالا تشکیل شده است جدا و به یک لوله فالکون جدید منتقل نماییم. حال از آنجا که فایکول سمی است و بایست شسته شود، با محیط کشت RPMI حجم لوله فالکون را به 7 رسانده و مجددا در سانتریفیوژ با دور 1500 و به مدت 7 دقیقه سانتریفیوژ میکنیم تا سلولها جدا و تهنشین گردند. بعد از شسته شدن سلول ها آنها را به تعداد مناسب در محیط کشت RPMI رسوسپاند میکنیم.
3-12 برخی از پروتکلهای رایج کشت سلولی به کار رفته در این پایان نامه (Mcateer J.A. 1994)
پروتکل 1_ پاساژ سلولهای چسبنده
1) محیط کشت را به وسیله پیپت خارج میکنیم و بستر سلولی را با حدود 5 سی سی محلول RPMI 1640 حاوی سرم جنین گاوی شست و شو میدهیم.
2) محلول RPMI 1640 را خارج کرده، به فلاسک 1 سی سی محلول تریپسین-EDTA اضافه میکنیم. فلاسک را به گونه ای حرکت می دهیم که محلول به همه بستر فلاسک برسد.
3) در فلاسک را بسته و به مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه میکنیم. بایست دقت کرد که فلاسک بر سطحی تراز قرار گرفته باشد.
4) با میکروسکوپ معکوس بسته به نوع سلول در فواصل زمانی مشخص روند جداشدن سلولها را از کف فلاسک بررسی میکنیم.
5) وقتی سلولها شروع به کنده شدن از کف فلاسک کردند، این روند را میتوان با ضربات ملایم به فلاسک تسریع کرد.
6) با حدود 10 سی سی محیط، سلول ها را شسته و به لوله سانتیفیوژ منتقل کرده و به منظور تعلیق همگون، سلولها را به آرامی چندین بار پیپت میکنیم تا لختههای سلولی شکسته شود.
7) 5/0 سی سی از سوسپانسیون سلولی را به منظور شمارش و تعیین میزان حیات سلولی بر میداریم.
8) سلولها را در 1200 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کرده، محیط رویی را دور ریخته و سلولها را دوباره به حال تعلیق در میآوریم.
9) به منظور پاساژ سلولی مقدار مشخصی ( مثلا 10 سلول) را به فلاسکهایcm2/ 75 حاوی 15 سی سی محیط کامل همراه با 10 % FBS و پنی سیلین- استرپتومایسین منتقل می کنیم.
10) در فلاسک را شل کرده ( فقط به اندازه ای که تبادل گازی ممکن باشد) و آن را در دمای 37 درجه سانتیگراد و در رطوبتی برابر 95 % و 5 % CO2 درون انکوباتور میگذاریم.
11) محیط فلاسک را هر 48 ساعت بایست تعویض و تازه نمود.
پروتکل 2_ شمارش سلولی با استفاده از هماسیتومتر نئوبار اصلاح شده (جهت تهیه سوسپانسیون سلولی با غلظت مشخص)
1) طبق پروتکل 1 سوسپانسیونی از سلول در محیط کشت تهیه میشود.
2) لاملی تمیز را روی هماسیتومتر قرار میدهیم.
3) با استفاده از پیپت پاستور به ملایمت سلول ها را پیپت میکنیم.
4) هماسیتومتر را به گونهای با سوسپانسیون پر میکنیم که همه خانههای مورد شمارش را فرا بگیرد ولی در عین حال سرریز