پایان نامه درباره سرطان پستان، استان مازندران، زنان باردار

مورفیسم BsmI,TaqI,ApaI,, انتهایPolyA با سرطان پستان در سال 2001:
D-Brethertan-waltو همکاران در سال 2001 گزارش کرده اند که ارتباط بین پلی مورفیسم های VDRوخطر ابتلا به سرطان پستان در زنان قبل وبعد از یائسگی ممکن است متفاوت باشد و رژیم غذایی نیز ممکن است در تعدیل خطر موثر باشد همچنین آن ها هیچ ارتباطی میان پلی مورفیسم VDR TaqIخطر ابتلا به بیماری سرطان پستان مشاهده نکردند علاوه بر این اظهار داشتند که یک عدم تعادل پیوندی قوی بین BsmI,ApaI,TaqI, و انتهایPoly Aوجود دارد به طوری که تنها دو هاپلوتیپ baTLوBats وجود دارد که به نظر می رسد هاپلوتیپ baTL با افزایش خطر در سرطان پروستات و سینه در ارتباط است(دسمدت,2006 1 ).
ارتباط پلی مورفیسمApaI,BsmI,TaqI و سرطان پستان در سال 2002:
Ming-fengو همکاران در سال 2002 ارتباط پلی مورفیسم های گیرنده APaI ,BSMI ,TaqI در پایانه’3 ژن VDR با سرطان پستان اسپوردایک بررسی کردند و آن ها مشاهده کردند اثرات مختلف از الل های مختلف از ژنوتیپ VDR در خطر ابتلا به سرطان پستان که یک روند رو به رشد برای سرطان پستان در الل های B BSMI,AAAPaI وجود دارد ولی هیچ اثری از ژنوتیپTaqI برای ابتلا به سرطان پستان وجود نداشت . Ruggieroوهمکاران نیز شیوع چهار برابری از ژنوتیپ bbBsmI نسبت به ژنوتیپ BB را در افراد سفید پوست مبتلا نشان دادند(فنگ و همکاران 2002).
?پلی مورفیسمApaI،BsmI،FokIوانتهایpoly A و سرطان پستان سال 2004:
تحقیقات انجام شده توسط Sillanpaa-p و همکارانش در سال 2004 نشان داد که اختلاف معنی‌داری در توزیع ژنوتیپ‌های جایگاه پلی‌مورفیکApaI بین گروه مبتلا به سرطان پستان و گروه کنترل وجود دارد. بطوری که زنان با ژنوتیپ‌های Aa وaa در مقایسه با زنان با ژنوتیپ AA خطر کاهش‌یافته‌ای را برای ابتلا به سرطان پستان نشان می‌دهند. این همبستگی بخصوص در بین زنان با تاریخچه خانوادگی مثبت برای سرطان پستان، بیشتر دیده می شود. ضمناً با افزایش تعداد الل‌های a از جایگاه پلی‌مورفیکApaI ژن VDRخطر ابتلا به سرطان پستان افزایش می یافت.به طوری که در زنان با ژنوتیپaaدر مقایسه با زنان با ژنوتیپ AAکمترین خطر برای ابتلا به سرطان پستان دیده می‌شود.در همین سال پژوهش دیگری توسط Guy Mو همکارانش انجام شد که نشان داد بین جایگاه پلی‌مورفیسم BsmI و پلی‌مورفیسم واقع در انتهایpoly A ژنVDR با خطر ابتلا به سرطان پستان همبستگی معنی‌داری وجود دارد. اما بین جایگاه پلی‌مورفیک FokIو خطر ابتلا به سرطان پستان (زمانی که این جایگاه به صورت مجزا بررسی شد) وجود نداشت(سیلانپا و همکاران, 2004 1).
پلی مورفیسمBsmI،سطح25(OH)Dوسرطان پستان سال 2005:
بر اساس تحقیقات انجام شده توسط lowe Lcو همکارانش در سال 2005 چنین نتیجه‌گیری شد که سطح پایین 25(OH)Dپلاسمایی به تنهایی ونیز همراه با ژنوتیپ bbاز جایگاه پلی‌مورفیکBsmIژن VDR ممکن است که موجب افزایش خطر ابتلا به سرطان پستان شوند(لویی و همکاران,2005 2).
ارتباط گیرنده FokI, BsmI با سرطان پستان مهاجم در سال 2008:
M.Sinotte و همکارانش در یک مطالعه مورد شاهدی از جمعیت فرانسویی کانادایی نشان دادند که پلی مورفیسم FokIVDR در ارتباط است با افزایش خطر سرطان پستان مهاجم Brethertonوهمکاران در سال2001 Guy? وهمکاران در سال 2003و2004 گزارش کردند که خطر نسبی پایینی برای سرطان پستان در حاملین الل f وجود دارد .
کوران وهمکاران در سال1999وآنجل وهمکاران در سال 2000ومک کالو وهمکاران در سال 2007 هیچ ارتباطی برای FokIوسرطان پستان مشاهده نکردند در مطالعه دیگر چن وهمکاران در سال 2005 انجام دادند متوجه شدند که حاملینff افزایش قابل توجهی در خطر ابتلا به سرطان پستان نسبت به ژنوتیپ FF نشان دادند.
همچنین M.Sinotteوهمکاران نشان دادند که پلی مورفیسم BsmI تنها یک ارتباط ضعیف با خطر ابتلا به سرطان پستان دارد آنجل و همکاران در جمعیت اسپانیایی وهومر همکاران در جمعیت تایوانی افزایش خطر برای حاملین BBBsmI گزارش کرده اند همچنین Brethertonوهمکاران ,Guyو همکاران Loweو همکاران در 2005 افزایش خطر قابل توجهی برای حاملینbb گزارش کرده اند( سینوته وهمکاران, 2008 1).
ارتباط گیرندهTru9I با سرطان کولورکتال در سال 2005:
در یک مطالعه توسط You -ling Gongو همکاران در سال 2005 برای اولین بار ژن Tru9IVDRرا به عنوان عامل خطر برای سرطان کولورکتال ارزیابی کردند که نشان می دهد جهش الل u از ژن Tru9I با کاهش خطر در سرطان کولورکتال به ویژه برای آدنوم ودیسپلازی در ارتباط استو آن ها یافتندکه الل u باعث کاهش خطر به ویژه در میان اشخاصی که جوان ترندو آن هایی که اصلا سیگار مصرف نمی کردند و همچنین نشان دادند که با توجه به اطلاعات باید تعاملبین پلی مورفیسم ژن Tru9Iو مصرف کلسیم و ویتامین وجود داشته باشد ولی آن ها این تعامل را نیافتند ولی از سوی دیگر نشان دادند که تعامل احتمالی بین ژنوتیپTru9Iو جنس و مصرف مشروبات الکلی وجود دارد(لینگ گونگ و همکاران ,2005 2).
?
فصل سوم
مواد و روش ها
جامعه مورد مطالعه:
جامعه مورد مطالعه را مجموعاً 260 زن (130 کنترل و130 بیمار ) بین سنین سال، از زنان استان مازندران تشکیل می دهند که با درنظر گرفتن معیارهای ورود و خروج از جامعه، به دو گروه کنترل و بیمارومبتلا به سرطان پستان تقسیم می شوند.زنان مبتلا به سرطان پستان که بیماریشان قبلا” توسط پزشک معالج وانجام آزمایشات پاتوبیولوژی تأئید شده بود، با مراجعه به بیمارستان شهید رجائی بابلسر موافقت نامه ای را که شامل پرسشنامه ای حاوی اطلاعات راجع به محل تولد، سکونت، سن، نسبت پدر و مادر، سابقه خانوادگی سرطان پستان، سابقه مصرف ویتامین D بود، پرکردند ومشخصات تن سنجی آنها شامل قد، وزن، دورکمر، دورباسن توسط یک فرد تعلیم دیده اندازه گیری شد.
زنان گروه کنترل نیز ازبین مراجعین بیمارستان شهید بهشتی بابل، پس ازاطمینان ازسالم بودن آنها با انجام معاینات بالینی و درصورت لزوم سونوگرافی و یا ماموگرافی، انتخاب شدند و پرسشنام? فوق را پرکردند و مشخصات تن سنجی آنها نیز اندازه گیری شد.
معیارهای ورود به جامعه: زنان بیمار و سالم که ساکن واصلیت آن ها نیز متعلق به استان مازندران بوده و تمایل به شرکت درمطالعه را داشتند.
معیارهای خروج از جامعه: زنان بیمار وسالمی که سابقه مصرف ویتامین D را داشتند و همچنین زنان باردار که اندازه گیری مشخصات تن سنجی آن ها امکان پذیرنبود، از مطالعه کنار گذاشته شدند.
روش اجرا: از هرزن حدود 5 میلی لیتر خون گرفته شد که 3 میلی لیتر خون آن به یک لوله حاوی ضد انعقاد EDTA جهت استخراج DNAمنتقل شد و تا زمان استخراج DNAدرفریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد. 2 میلی لیتر نیز به یک لوله جهت تهیه سرم برای انجام آزمایش بیوشیمیایی منتقل شد و سرم بلافاصله پس ازلخته شدن خون جدا و ابتدا 24 ساعت در دمای 20- درجه سانتی گراد وسپس تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شد.
سطح 25( OH )Dسرم توسط توسط دستگاه و کیتهای LIAISONآلمان با روشایمنواسی کمی لومینسانس(CLIA) Immunoassay Chemiluminescence][ اندازه گیری شد. نمایه توده بدنی (Body Mass Index or BMI ) با تقسیم وزن ( کیلوگرم) بر مربع قد ( مترمربع) و نسبت دور کمر به دور باسن (Waist / Hip Ratio or WHR ) با تقسیم دور کمر(سانتیمتر) بر دور باسن ( سانتیمتر ) بدست آمد.
استخراج DNA ژنومی:
در این مطالعه نمونه‌های DNA ژنومی طبق روشSalting out جدا گردید.
مواد مورد استفاده:EDTA، با فرلیزکننده ،محلول PBS، بافر TES،تریتون، آب مقطر، محلولSDS10%، پروتئیناز (1mg/ml) K، محلول نمک اشباع (NaCl 5m)،ایزوپروپانول، اتانول 75%،آب مقطر اتوکلاو شده سرد
روش تهیه ترکیبات مورد نیاز:
با فرلیزکننده
Tris-base (1 M)pH 7.6 10 cc
MgCl (0.5M) 10 cc
Sucrose 109.5 g r
Triton X- 100 10 cc
ابتدا سه ماده اول در 800 میلی‌لیتر آب مقطر حل شده و pHروی 6/7 تنظیم شد، سپس تریتون قطره قطره در حالی که محلول روی همزن مغناطیسی هم می‌خورد اضافه شد، تا آنکه تریتون به طور کامل حل شد. سپس حجم به 1000 میلی‌لیتر رسانده شد و مجدداً pH تنظیم گردید.
محلول PBS
NaCl 8 gr
KCl 0.2 gr
KH2Po4 0.24 gr
مواد فوق در 800 میلی‌لیتر آب مقطر حل شده و PH روی 4/7 تنظیم شد و پس از آن حجم به 1000 میلی‌لیتر رسانده شد.
بافر TES
Tris-base (1 M) pH 7.5 10 cc
NaCl (6M) 67 cc
EDTA 200 cc
مواد فوق در 700 میلی‌لیتر آب مقطر حل شده و PH روی 5/7 تنظیم شد و سپس حجم به 1000 میلی‌لیتر رسانده
مراحل استخراجDNA از نمونه خون
1- 3 میلی‌لیتر از خون بیمار در یک لوله آزمایش حاوی محلول3 میلی‌گرم در لیتر EDTA ریخته شد و به آرامی مخلوط گردید تا مانع عمل انعقاد شود. نمونه‌ها تا زمان استخراج DNA در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
2- 3میلی‌لیتر از بافرلیز کننده سرد به هر نمونه اضافه گردید و با تکان‌های شدید، نمونه با محلول بافر لیز‌کننده به خوبی مخلوط شد.
نمونه‌های مخلوط شده با بافرلیز کننده به مدت 10دقیقه در دور rpm3000 سانتریفوژ شد.
3- پس از خاتمه سانتریفوژ، محلول رویی دور ریخته شد و به لخته باقی‌مانده 5 میلی‌لیتر از محلول PBS اضافه گردید و نمونه طوری مخلوط شد که توده حاوی گلبول‌های سفید کاملاً باز شود و مجدداً لوله در دور rpm3000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند.
4- این مراحل تا سفید شدن کامل توده ادامه پیدا کرد.
5- پس از خاتمه آخرین مرحله محلول رویی دور ریخته شد و به توده حاوی گلبول‌های سفید باقی‌مانده 1 میلی‌لیتر آب مقطر سرد (اتوکلاو شده) اضافه شد سپس محتویات لوله به یک میکروتیوب 5/1 میلی‌لیتری منتقل گردید.
6- میکروتیوب‌ها در دور rpm5000 به مدت 1 دقیقه سانتریفوژ شدند.
7- محلول رویی دور ریخته شد و به هر تیوب?600بافر TES اضافه شد و مخلوط گردید.
8- به هر تیوب ?100 از محلولSDS10%و ?50پروتئیناز (1mg/ml) K اضافه شد و پس از مخلوط نمودن میکروتیوب‌ها یک شب در دمای C°55 روی شیکر قرار داده شد.
9- به نمونه‌های حاصل از هضم به اندازه یک سوم حجم شان نمک اشباع (NaCl 5m) اضافه شد و پس از مخلوط نمودن ملایم، به مدت 10 دقیقه در سرما و با دورrpm12000 سانتریفوژ گردیدند.
10- محلول رویی به میکروتیوب دیگری منتقل گردید و برابر حجم آن الکل ایزوپروپانولی که در 20- درجه سانتیگراد نگهداری می شد، اضافه گردید سپس میکروتیوب‌ها تکان داده شدند تا رشته‌های DNA ظاهر شوند.
11- میکروتیوب‌ها در دور rpm12000 در سرما به مدت 2 دقیقه، سانتریفوژ شدند.
12- محلول رویی دور ریخته شد و DNA سه مرتبه با اتانول 75% شست و شو داده شد و هر بار میکروتیوب‌ها در دور rpm12000 و در سرما به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند.
13- در مرحله آخر پس از خارج کردن محلول رویی، میکروتیوب‌ها روی کاغذ خشک‌کن برگردانده شدند و اجازه داده شد تا DNA به طور کامل خشک شود.
14- به هر میکروتیوب?200آب مقطر اتوکلاو شده اضافه شد و اجازه داده شد تا DNA در آن به طو ر کامل حل شود و محلول یکنواختی حاصل شود.
15-نمونه‌ها شماره‌گذاری شده و در یخچال نگهداری شدند
تعیین غلظت DNA استخراج شده با روش اسپکتروفتومتری:
پس از استخراج DNA به منظور ارزیابی کمیت و کیفیت DNAو آگاهی از غلظت و درجه خالص بودن آن، نمونه DNA هزار برابر رقیق شده و با استفاده از اسپکتروفتومتر CAMSPE مدل: M 501-Single Beam Scaning uv/ Visible Spectrophotometerساخت کشور انگلستان که دارای برنامه برای DNA