پایان نامه ارشد درباره رادیکال، کروماتوگرافی، می‌شود.

ه پایین مبرد) وکمی پایین‌تراز قسمت زیر مبرد ودرآخر بازو که حلال برگشت می شود؛ استخراج می گردد [4].
امروزه با توسعه روش‌ها علاوه بر SDE در فشار اتمسفر، روش‌های دیگری مثل SDE در مقیاس‌میکرو، SDEدر مقیاس تهیه‌ای و SDE در فشار کاهش‌یافته یا خلأ به کار گرفته شده است. از مزایای استخراج ‌و تقطیر همزمان؛ تک‌مرحله‌ای بودن، سرعت عمل، حجم حلال مصرفی کم به‌خاطر بازیافت مداوم و اسانس‌های عاری از ترکیبات غیرفرار مثل کلروفیل است و در روش SDEبا مقیاس ‌میکرو ضمن مصرف حلال کم، نیازی به غلیظ‌سازی عصاره نیست که باعث کاهش هدررفت ترکیبات فرار می‌شود [17،21 و 22].
شکل1-5: دستگاه تقطیر و استخراج همزمان
1-3- ترکیب‌های ضد اکسیدان
ضد اکسیدان‌ها موادی هستند که در غلظت کم و با سازوکاری ویژه از عمل اکسایش جلوگیری می کنند ویا باعث کاهش ویا به تأخیر افتادن آن می شوند [23] .
سال‌های سال است که به منظور جلوگیری از تخریب مواد غذایی که به دلیل اکسایش چربی‌های غیراشباع و سایر عوامل روی می‌دهد، ضد ‌اکسیدان‌ها را به فراورده‌های غذایی می‌افزایند. به هر حال بسیاری از ضد ‌اکسیدان‌های مصنوعی که طی 50 سال اخیر مورد استفاده بوده‌اند، برای مصرف‌کنندگان امروزی که به دنبال مواد غذایی هرچه طبیعی‌تر می‌گردند، دیگر قابل‌قبول نیستند. این امر باعث جستجو برای یافتن ضد ‌اکسیدان‌های طبیعی شد که جزء اصلی سازنده‌شان مواد فنلی می‌باشد [5].
ویژگی‌های اکسیدکنندگی اکسیژن نقش حیاتی در اعمال بیولوژیکی متفاوت مثل استفاده از غذا، انتقال الکترون برای تولید ATPدارد، در حالی که اکسیژن برای حیات ضروری است، همچنین می‌تواند باعث اکسید کردن مواد درون سلول شود و نقش تخریب کننده داشته باشد. اکسیژن می‌تواند به اشکال بسیار فعال مثل رادیکال‌های سوپراکسید، رادیکال‌های هیدروکسیل و هیدروژن پراکسید تبدیل شود و به این صورت می‌تواند به DNA آسیب برساند، یا اینکه آنزیم‌های ضروری و پروتئین‌های ساختاری را تخریب کند. همچنین می‌تواند واکنش‌های زنجیره‌ای از کنترل خارج شده مثل واکنش‌های اکسایش خود به خودی و پراکسیداسیون را برانگیزد.
پلی فنل‌ها انواعی از ضد ‌اکسیدان‌ها هستند که در جلوگیری از بسیاری بیماری‌ها از جمله سرطان نقش دارند، این ترکیبات بسیار متنوع هستند واثرات متفاوتی دارند. ترکیبات فنلی شامل ویتامین‌ها، رنگدانه‌ها و فلاونوئیدها، ویژگی‌های ضدجهشی ودر نتیجه ضد سرطانی و همچنین فعالیت کاهش قند خون را برعهده دارند [24].
1-3-1- روش های سنجش فعالیت ضد ‌اکسیدانی
این روش‌ها بر دو اصل استوار است که عبارتند از:
الف) روش هایی که مبنای آن‌ها انتقال اتم هیدروژن است .
این سنجش‌ها براساس توانایی ماده ضد اکسیدان برای رقابت با ماده شیمیایی مستعد اکسایش (جز مورد عمل) درانتقال اتم هیدروژن به رادیکال های آزاد ارزیابی می شود . دراین روش اغلب از یک تولید کننده رادیکال که رادیکال های پایدار با طول عمر کوتاه تولید می‌کند؛ استفاده می شود همچنین علاوه بر ضد اکسیدان، مولکول قابل اکسایش نیز استفاده می‌شود . ضد اکسیدان های اضافه شده با جز مورد عمل برای گرفتن رادیکال آزاد رقابت می‌کنند. از آن جایی که در بررسی ظرفیت ضد اکسیدانی عصاره از آزمایش مهار اکسایش لینولئیک اسید استفاده شد [25] . دراین جا به شرح این روش پرداخته می شود.
1-3-1-1- آزمون بی‌رنگ شدن بتا کاروتن در حضور لینولئیک اسید32
دراین روش لینولئیک اسید در محیط آبی اشباع از اکسیژن مولکولی (O2) اکسید شده وبه رادیکال آزاد مربوطه LOO. تبدیل می شود. این رادیکال آزاد در مرحله بعد با جذب هیدروژن اتمی (H· ) ازبتاکاروتن موجب اکسید شدن آن و زایل شدن رنگ زرد نارنجی ناشی ازآن می شود . وجود ماده ضد اکسیدان در محیط می تواند با بتاکاروتن در دادن هیدروژن اتمی رقابت نموده واز زایل شدن رنگ جلوگیری نماید . این آزمایش نمونه ای از سنجش به روش انتقال اتم هیدروژن است ودرآن میزان زوال رنگ بتا کاروتن با سنجش میزان جذب نور آن در طول موج 470 نانومتر معین می شود [26و27] .
ب) روش‌هایی که مبنای آن‌ها انتقال الکترون است.
1-3-1-2- سنجش مقدار تام فنل با FCR33
این روش ابتدا برای پروتئین‌ها به کار رفت واساس آن تمایل به باقی مانده تیروزین است (آمینو اسید تیروزین دارای یک گروه فنلی است.) چند سال بعد سینگلتون34 وهمکارانش این روش را برای آنالیز مقدار تام فنل در شراب به کار بردند و به تدریج این روش کاربرد زیادی پیدا کرد.
معرف فولین سیوکالتیو از جوشیدن مخلوط سدیم تنگستات (Na2WO4.2H2O) ، سدیم مولیبدات (Na2MnO4.2H2O)، اسید کلریدریک غلیظ و اسید فسفریک 85% به همراه افزودن آب تهیه می شود و سپس لیتیم سولفات (li2SO4.4H2O) به مخلوط اضافه می شود تا مخلوط زردرنگ که همان معرف است؛ تهیه شود. وجود احیا کننده در محیط باعث ایجاد رنگ سبز رنگ و اضافه کردن اکسید کننده مثل برومین رنگ زرد را حفظ می کند . طبیعت شیمیایی دقیق واکنشگر FC ناشناخته است . عقیده بر این است که حاوی هتروپلی فسفو تنگستات35 است. در اثر واکنش های برگشت پذیر کاهش، گونه‌های آبی رنگی به وجود می آید که احتمال می رود به دلیل تشکیل 4- (PMoW11O40 ] [ باشد. دراین روش اعتقاد براین است که مولیبدینیوم به آسانی در مخلوط احیا می شود و واکنش انتقال الکترون بین احیا کننده و مولیبدینیوم اتفاق می‌افتد.
Mo (VI)yellow+e (Mo (V)green
معرف فولین- سیوکالتیو یک معرف غیر اختصاصی است و خیلی از ترکیب های غیرفنلی را هم احیا می کند که از معایب آن به شمار می رود. برای شناسایی ترکیب های فنلی محیط را با محلول سدیم کربنات تا PH حدود 10 قلیایی می‌کنند؛ در ضمن واکنش پروتون فنلی تبدیل به آنیون فنلات می شود که این آنیون قادر است معرف فولین – سیو کالتیو را احیا کند وآن را به رنگ سبز درآورد. سپس به روش رنگ سنجی مقدار تام فنل سنجیده می شود. ترکیبات آبی رنگی که بین فنلات و واکنشگر FC تشکیل می شود؛ مستقل از ساختار ترکیب های فنلی است وکمپلکس بین ترکیب های فنلی وفلز مرکزی تشکیل می شود [29-28].
1-3-1-3- سنجش ظرفیت به دام انداختن رادیکال DPPH 36
روش ساده، سریع و ارزان برای اندازه‌گیری فعالیت ضد ‌اکسیدانی که شامل استفاده از رادیکال 2، 2-دی‌فنیل -1-پیکریل‌هیدازیل (DPPH) است. این رادیکال آزاد وپایدار است که می تواند یک الکترون و یا رادیکال هیدروژن قبول کند وبه یک مولکول خنثی و پایدار تبدیل شود . این ماده به دلیل دارا بودن الکترون منفرد دارای جذب قوی در طول موج 517 نانومتر می باشد که دراین مرحله، محلول متانولی آن بنفش رنگ است . در حضور ضد ‌اکسیدان با استفاده از این تغییر جذب می توان توانایی مولکول های مختلف را به عنوان مهار کننده رادیکال آزاد سنجید؛ درواقع میزان تغییر در جذب هرنمونه به قدرت و توانایی جاذب رادیکال بستگی دارد . احیا شدن DPPH و کاهش جذب در طول موج 517 نانومتر در دمای اتاق و پس از گذشت 5 دقیقه از شروع واکنش صورت می گیرد . مزیت کاربرد DPPH این است که در زمان کوتاهی می توان تعداد زیادی نمونه را اندازه گیری نمود و همچنین از حساسیت کافی برخوردار است.
نمودار صفحهی بعد احیا شدن DPPH را با یک نمونه ضد اکسیدان نشان می‌دهد:
نمودار 1-1 : نمودار جذب- طول‌موج برای DPPH در حضور ضد اکسیدان
جذب رادیکال DPPH در طول موج 517 نانومتر از قانون بیر- لامبرت تبعیت می کند و کاهش میزان جذب آن با میزان ماده ضد اکسیدان رابطه خطی دارد. به عبارتی در ازای افزایش هرچه بیشتر ماده ضد اکسیدانی، DPPH بیشتری مصرف می شود و رنگ آن از بنفش به زرد می گراید. غلظتی از ضد اکسیدان که باعث کاهش 50% از غلظت DPPH ابتدایی می‌شود با 37IC50 تعریف می شود . میزان IC50 وخاصیت ضد اکسیدانی با یکدیگر نسبت عکس دارند؛ به صورتی که هرچه میزان IC50 کمتر باشد خاصیت ضد اکسیدانی نمونه بیشتر است . این روش نقاط ضعفی هم دارد . گزارش‌ها نشان می دهد که واکنش DPPH با اوژنول برگشت پذیر است بنابراین برای نمونه های حاوی اوژنول ودیگر فنل‌ها با ساختاری مشابه با اوژنول ظرفیت ضد اکسیدانی را پایین‌تر از آنچه هست؛ نشان می دهد [27 ،30 و 31].
1-4- کروماتوگرافی‌گازی38
از متداول ترین روش ها برای آنالیز ترکیبات فرار گیاهی، استفاده از کروماتوگرافی گازی (GC) است. در این کروماتوگرافی‌ نمونه تبخیر و به سر ستون کروماتوگرافی ترزیق می‌شود. شویش با جریانی از فاز متحرک گازی بی‌اثر انجام می‌شود. برعکس اکثر انواع دیگر کروماتوگرافی، فاز متحرک با مولکول‌های آنالیت برهم‌کنش ندارد و فقط به عنوان وسیله‌ای برای گذار مولکول‌ها از داخل ستون عمل می‌کند. کروماتوگرافی گاز- مایع کاربرد گسترده‌ای در تمام رشته‌های علوم دارد و معمولاً با نام مختصر کروماتوگرافی گازی نامیده می‌شود. این کروماتوگرافی بر پایه تقسیم آنالیت بین یک فاز متحرک گازی و یک فاز تثبیت شده بر سطح یک جامد بی‌اثر بنا شده است.
1-4-1- اجزای اصلی دستگاه کروماتوگرافی گازی
1-4-1-1- مخزن گاز حامل
گازهای حامل که باید از نظر شیمیایی بی‌اثر باشند، عبارتند از هلیم، نیتروژن، و هیدروژن. انتخاب گاز معمولاً با توجه به آشکارساز به کار رفته انجام می‌شود. به همراه مخزن گاز، شیرهای تنظیم فشار، اندازه‌نماها و‌جریان‌سنج‌‌ها در دسترس قرار می‌گیرند.
1-4-1-2- سیستم تزریق نمونه
کارایی ستون به این نیاز دارد که اندازه نمونه مناسب باشد و به صورت توپی از بخار وارد شود؛ تزریق آهسته مقدار زیاد نمونه سبب پهن شدن نوار و کاهش تفکیک می‌شود. متداول‌ترین روش تزریق نمونه، استفاده از یک ریزسرنگ برای تزریق نمونه‌های مایع یا گازی از طریق یک درپوش غشایی خودبند یا دیافراگم لاستیکی سیلیکونی به درون دریچه تبخیرکننده آنی نمونه است که در سر ستون قرار دارد.
1-4-1-3- ستون ‌وآون‌ستون
در کروماتوگرافی گاز-مایع دو نوع ستون داریم؛ لوله‌پرشده و لوله‌باز یا مویین. طول ستون‌های کروماتوگرافی از کمتر از 2 متر تا50 متر یا بیشتر تغییر می‌کند. ستون‌ها از فولاد زنگ‌نزن، شیشه، سیلیس ‌جوش‌نخورده یا تفلون ساخته می‌شوند. برای جا دادن ستون‌ها در داخل آون‌های دماپای، معمولاً به شکل حلقه‌های با قطر 10تا30 سانتی‌متر ساخته می‌شوند.
دمای ستون متغیری مهم است که باید تا چند دهم درجه برای انجام کارهای دقیق کنترل شود و بنابراین ستون معمولاً در یک آون دماپا جا داده می‌شود. بهترین دما برای ستون به نقطه جوش نمونه و درجه جداسازی مورد نیاز بستگی دارد.تقریباً دمای معادل یا کمی بالاتر از متوسط نقطه جوش نمونه، به یک زمان شویش مناسب منجر می‌شود. برای نمونه‌های با گستره وسیع نقطه جوش، برنامه‌ریزی دما به کار گرفته می‌شود که در آن دمای ستون به طور پیوسته و یا مرحله‌ای افزایش می‌یابد، همچنان‌که جداسازی انجام می‌شود.
1-4-1-4- سامانه آشکارساز
طی توسعه کروماتوگرافی گازی، آشکارسازهای زیادی مورد بررسی قرار گرفته است؛ آشکارسازها نه تنها برای آشکارسازی حضور آنالیت‌ها در انتهای ستون به کار می‌روند بلکه همچنین اطلاعاتی در رابطه با تعیین هویت آنها در اختیار می‌گذارند.
آشکارساز یونش شعله39 (FID)
از متداول‌ترین آشکارسازهای مورد استفاده که عموماً برای کروماتوگرافی گازی اعمال‌پذیر است. سیال خروجی از ستون با هیدروژن مخلوط و سپس به طور الکتریکی مشتعل می‌شود. اکثر ترکیبات آلی، موقعی که در دمای شعله هیدروژن/هوا تفکافت شوند، یون‌ها و الکترون‌هایی تولید می‌کنند که الکتریسیته را از درون شعله هدایت می‌کنند. پتانسیلی چند صد ولتی در عرض نوک مشعل و الکترود جمع کننده در بالای شعله اعمال می‌شود. سپس