پایان نامه ارشد درباره میلی، گیاهی، تهیه

آبه
Merck
آلمان
-nپنتان
Merck
آلمان
کلسیم کلرید 2 آبه
Merck
آلمان
پتاسیم کلرید
Merck
آلمان
تخم آرتمیا
INC, Salt Lake City,UTAH 84126
آمریکا
محیط کشت آب‌گوشتی (BHI)
Merck
آلمان
محیط کشت آگار(SDA، PDA، NA)
Merck
آلمان
2-1-3- میکروارگانیسم‌ها و آنتی بیوتیک‌های مورد استفاده
جدول2-3: انواع میکروارگانیسمهای مورد استفاده
ردیف
میکروارگانیسم
1
Escherichia coli (ATCC 10536)
2
Bacillus subtilis (ATCC 6633)
3
Staphylococcus aureus (ATCC 29737)
4
Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031)
5
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)
6
Shigella dysenteriae (PTCC 1188)
7
Proteus vulgaris (PTCC 1182)
8
Salmonella paratyphi-A serotype (ATCC 5702)
9
Candida albicans (ATCC 10231)
10
Aspergillus niger (ATCC 16404)
11
Aspergillus brasiliensis (PTCC 5011)
جدول2-4: آنتی بیوتیکهای مورد استفاده
آنتی‌بیوتیک
شرکت
کشور
Gentamicine
پادتن طب
ایران
Tetracycline
پادتن طب
ایران
Rifampin
پادتن طب
ایران
2-2- منابع گیاهی مورد استفاده
در این پژوهش از اندام‌های مختلف (ساقه و برگ _ دانه) گیاه شوکران باغی و اندام هوایی (ساقه و برگ) گیاه خار عروس استفاده شده است.
2-2-1-‌ جمع آوری وآماده سازی نمونه‌های گیاهی
گیاهان Morina persica L. و Physospermum cornubiense (L.) DC. در ماه‌های خرداد و تیر 1392 از روستای گردبیشه در ارتفاع 2200 متری از سطح دریا از شهرستان بروجن جمع‌آوری شد و پس از شناسایی جنس وگونه آن توسط گیاه شناس باغ گیاه شناسی کاشان به آزمایشگاه منتقل گردید ودر شرایط مناسب وبه دور از نور خورشید خشک گردیده و آسیاب شد .
2-3- جداسازی واستخراج عصاره ازنمونه گیاهی
در این پروژه عمل استخراج به روش سوکسله وبا حلال متانول صورت گرفت که مراحل مختلف کار در ادامه آورده شده است.
2-3-1- عصاره گیری از نمونه های گیاهی
در مورد گیاه خارعروس gr40 از آن توزین شد و با کارتوش به دستگاه سوکسله انتقال ودر محل مخصوص خود (تیمبل) قرار گرفت . عمل عصاره گیری با افزودن 600 میلی لیتر حلال متانول به داخل بالن دستگاه سوکسله وپس از اطمینان از برقراری جریان آب سرد در مبرد دستگاه عمل عصاره گیری با دمای 70-60 درجه سانتی گراد آغاز شد وبه مدت 8 ساعت به طول انجامید . محلول بدست آمده با تبخیرکن دوار در دمای 50 درجه سانتی گراد وفشار کاهش یافته، تغلیظ گردید تا به حجم 5-4 میلی لیتر برسد . عصاره تغلیظ شده برای خشک شدن کامل به پتری‌دیش منتقل و ابتدا درآون معمولی در دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت نگهداری شدتا بقیه حلال تبخیر شود و سپس به آون خلأ برای حذف باقی مانده مواد فرار موجود درعصاره انتقال داده شد. عصاره‌های متانولی حاصل از گیاه با اسپاتول تراشیده و به ظروف در‌پوش‌دار و غیر قابل نفوذ منتقل گردید و به منظور جلوگیری از تجزیه و یا از بین رفتن مواد موثر موجود در عصاره‌ها تا انجام آزمایش های بعدی در یخچال نگه‌داری شد.
عصاره بدست آمده از دانه های گیاه شوکران باغی را در 150 میلی لیتر آب حل کرده و 3 بار با 50 میلی لیتر هگزان توسط قیف دکانتور استخراج کرده تا روغن و چربی وارد فاز هگزانی شود وعمل حلال زدایی را مانند قسمت بالا انجام داده در یخچال نگهداری می کنیم.
2-3-2- تعیین بازده عصاره‌گیری
با استفاده از وزن گیاه خشک مورد استفاده در عصاره گیری و وزن عصاره بدست آمده بازده عصاره به صورت نسبت وزنی/ وزنی w/w ) (محاسبه شد که حاصل‌ضرب این نسبت در 100 راندمان عصاره‌گیری رابرحسب درصد مشخص می کند.
2-4- استخراج ترکیبات فرار گیاهی
برای استخراج ترکیبات فرار بخش‌های مختلف گیاه، از روش تقطیر واستخراج همزمان و از دستگاه SDE استفاده شد. 200 گرم از گیاه خشک آسیاب شده را پس ازتوزین به بالن 2 لیتری منتقل شد و برروی آن آنقدرآب اضافه شد که مجموع نمونه گیاهی وآب حدود ?(2/3) حجم بالن را اشغال نماید . حدود 35 میلی لیتر پنتان دربالن 100 میلی لیتری دستگاه ریخته وبالن‌ها رادرون شوف بالن (منتل) قرارداده ودستگاه اسانس‌گیری راه اندازی شد . پس از برقراری جریان آب سرد درمبرد دستگاه و تنظیم درجه حرارت بالن‌ها عمل اسانس گیری به مدت 2 ساعت ادامه یافت. پس از اتمام عمل استخراج مقداری سدیم سولفات بدون آب درون اسانس همراه با پنتان برای جذب آب احتمالی موجود در آن اضافه شد، سپس اسانس حاصل به مدت 24 ساعت درون یخچال قرار دادهوپس از مدت حدوداً 24 ساعت درون ویال تیره رنگی سرریز شد و به منظور تغلیظ اسانس و تبخیر حلال ساعاتی در دمای آزمایشگاه قرار داده شد و در دمای 4+ درجه سانتی گراد برای تزریق به دستگاه GC نگهداری شدند. در ضمن از تفاضل وزن ویال پس از جمع آوری اسانس درآن و قبل از آن، وزن خالص ترکیبات فرار محاسبه گردید.
2-4-1- تعیین بازده اسانس‌گیری
با استفاده از وزن گیاه خشک مورد استفاده در اسانس گیری و وزن اسانس بدست آمده بازده اسانس به صورت نسبت وزنی/وزنی (w/w) محاسبه شد که حاصل ضرب این نسبت در 100، بازده اسانس گیری را برحسب درصد مشخص می کند.
2-4-2- شناسایی ترکیب‌های فرار گیاه با دستگاه GC-MS
نمونههای ترکیبات فرار گیاهی با دستگاه GC/MS حاوی ستون HP- 5MS (طول 30 متر، قطر داخلی 25/0 میلیمتر، ضخامت لایه ساکن ??/0 میکرومتر) و گاز حامل هلیم با درجه خلوص ??999/?? آنالیز شدند. در ضمن سرعت جریان گاز حامل 5/1 میلی‌لیتر بر دقیقه و انرژی یونیزاسیون در طیفسنج جرمی ?? الکترون ولت انتخاب گردید. برنامه دمایی دستگاه به این صورت تنظیم گردید: ابتدا دما به مدت ? دقیقه در 60 درجه سانتیگراد نگه داشته شد، سپس به دمای 246 سانتیگراد با سرعت 3 درجه بر دقیقه افزایش یافت، و به مدت ? دقیقه دراین دما باقی ماند، سپس به دمای ?8? سانتیگراد افزایش یافته و به مدت 10 دقیقه در این دما باقی ماند .
برای شناسایی ترکیبهای فرار گیاه، مراحل زیر انجام گرفت.
الف) با توجه به پیشنهادهایی که کتابخانه دستگاه GC-MS ارائه داد؛ هر یک از آنها جداگانه مورد بررسی قرار گرفت.
ب) طیف‌های جرمی به دست آمده با طیف‌های موجود در کتاب Adams مقایسه گردید [50].
ج) با توجه به زمان بازداری هر پیک، ضریب بازداری کواتس KI ) (هر یک از طریق معادله مربوط به محاسبه ضریب کواتس به دست آمد و با ضریب کواتس موجود در منابع (کتاب Adams و سایت NIST) در شرایط مشابه مقایسه گردید.
2-5- بررسی فعالیت ضد اکسیدانی
2-5-1- بررسی فعالیت ضد اکسیدانی به روش DPPH
در این پروژه خاصیت ضد اکسیدانی عصاره اندام‌های مختلف گیاهان Morina persica L. و Physospermum cornubiense (L.) DC. از طریق اندازه گیری ظرفیت کاهش رادیکال DPPH (2، 2- دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل) مورد بررسی قرار گرفت. دراین ارزیابی توانایی عصاره گیاهی (به عنوان ضد اکسیدان) در دادن الکترون به رادیکال DPPH مورد سنجش قرار گرفت.
تهیه محلول‌ها
محلول DPPH : میزان 7/4 میلی گرم از DPPH با ترازوی آنالیتیکی به طور دقیق وزن ودربالن ژوژه 50 میلی لیتری تیره رنگ بامتانول به حجم رسید . محلول بدست آمده رنگ ارغوانی داشت.
محلول شاهد : میزان 1 میلی‌لیتر از متانول که به آن 1 میلی لیتر از محلول DPPH اضافه شد. (جذب آن باید در بازه 7/1-1/1باشد.)
الف) نمونه استانداردBHT
برای بررسی خاصیت ضد اکسیدانی عصارههای گیاهی، مقایسه نتایج به دست آمده از این عصارهها، با مواد ضد اکسیدان استاندارد، امری ضروری است. یکی از این مواد استاندارد بوتیل هیدروکسی تولوئن میباشد.
غلظت‌های 1، 8/0، 5/0، 25/0، 1/0، 05/0،0 005/0، 0005/0و 00005/0 میلی گرم بر میلی لیتر در 8 عدد بالن ژوژه 10 میلی لیتر تهیه گردید. سپس 8 عدد بالن ژوژه 5 میلی لیتر هم تهیه شد که 1 میلی لیتر از هر کدام از این محلولها را به درون بالنها انتقال یافت. بعد 1 میلی لیتر از محلول DPPH تهیه شده به این بالنها اضافه شد. همچنین در یک بالن 5 میلی‌لیتر دیگر 1 میلی لیتر متانول و 1 میلی لیتر از DPPH به عنوان شاهد اضافه گردید. پس از 30 دقیقه، محلول‌های با غلظت ضد اکسیدان بیشتر در اثر احیا از بنفش به زرد تغییر رنگ پیدا کرد. سپس جذب هر کدام از محلولها را با صفر کردن توسط محلول متناظر، در طول موج 517 نانو متر با دستگاه UV/Vis خوانده شد. برای خواندن جذب محلول شاهد از متانول مرک به عنوان استاندارد برای صفر کردن دستگاه استفاده شد. پس از محاسبه درصد مهار برای هر غلظت طبق رابطه مذکور در قسمت بعدی، نمودار درصد مهار بر حسب منفی لگاریتم غلظت (میلی گرم بر میلی لیتر) رسم شد.
ب) عصاره‌های گیاهی : از عصاره‌های گیاهی به‌طور مجزا یک غلظت پایه تهیه شد به این ترتیب که 25 میلی‌گرم از هر عصاره به‌طور جداگانه توزین شد ودریک بالن ژوژه 25 میلی لیتر با متانول به حجم رسانده شد. پس ازتهیه محلول پایه برای عصاره چند غلظت رقیقتر هم طبق غلظت هایی که در مورد BHT گفته شد تهیه گردید. تهیه محلولهای عصاره از محلول پایه به روش رقیق سازی متوالی انجام شد. به 1 میلی لیتر از هر محلول عصاره 1 میلی لیتر از محلول DPPHاضافه شد. محلولهای شاهد وعصاره به مدت نیم ساعت در فضای تاریک نگه داری شد ودر طول این مدت مقداری تکان داده شد تا محلولها کاملاً همگن شوند. جذب هریک از این محلول ها با دستگاه UV/Vis در طول موج 517 نانومتر قرائت شد. درهرمرحله از خواندن جذب به شاهدی برای صفر کردن دستگاه لازم است که حاوی مواد شیمیایی یکسان با آن ( حلال و نمونه گیاهی ) وفاقد رادیکال آزاد DPPH است. در صد مهار با فرمول زیر محاسبه شد:
در این فرمول Ablank و Asample به ترتیب میزان جذب شاهد ونمونه می باشند . مقدار IC50 نشان دهنده غلظتی از ترکیب است که موجب 50% بازدارندگی در ظرفیت رادیکالی می‌گردد سپس منحنی درصد مهار برحسب منفی لگاریتم غلظت رسم شد و با کمک آن IC50 قابل محاسبه است. (این آزمون سه مرتبه تکرار شد).
در مورد گیاه Physospermum cornubiense (L.) DC. همه غلظت های عصاره گیاهی سر شاخه 2 برابر شده تا درصد مهار غلیظ ترین محلول بیشتر از 90? باشد.
2-5-2- اندازه‌گیری مقدار کل ترکیبات فنلی
برای اندازه گیری مقدار کل ترکیبات فنلی از روش فولین- سیکالتو و گالیک اسید به عنوان استاندارد استفاده شد .
تهیه محلول 2% سدیم کربنات : میزان 7/2 گرم از سدیم کربنات در بالن ژوژه 50 میلی لیتری با آب تقطیر شده به حجم رسید .
تهیه محلول شاهد : 2/0 سی سی حلال DMSO، یک میلی لیتر معرف فولین سیوکالتو وپس از گذر سه دقیقه زمان، 3 میلی لیتر محلول سدیم کربنات 2% به بالن ژوژه 50 میلی لیتری منتقل و با آب مقطر به حجم رسید.
محلول‌های استاندارد گالیک‌اسید: محلول‌هایی از گالیک‌اسید با غلظت‌های 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شد. 1/0میلی‌لیتر از هریک از محلول‌ها به بالن‌های50 میلی‌لیتری حاوی آب مقطر افزوده شد. سپس به همه بالن‌ها 1میلی‌لیتر معرف فولین‌سیوکالتو اضافه شد. بعد از 3 دقیقه، 3 میلی‌لیتر محلول سدیم‌کربنات %2 افزوده و بالن‌ها با آب مقطر به حجم رسانده شد و به مدت 2 ساعت در محیط آزمایشگاه نگه داشته شد.
تهیه محلول از عصاره : میزان 10 میلی گرم از عصاره مورد نظر به طور دقیق با ترازوی آنالیتیکی وزن و در لوله آزمایش ریخته شد سپس میزان 2 میلی لیتر حلال DMSO به آن افزوده و در اثر هم زدن پیوسته با همزن ارتعاشی حل گردید .
سه نمونه از عصاره در سه بالن ژوژه50 میلی لیتری با مشخصات ذیل تهیه گردید.
میزان 2/0 میلی لیتر از محلول عصاره را برداشته وداخل بالن ژوژه 50 میلی لیتر ریخته و بر