منابع پایان نامه با موضوع بروسلا، بیماری، آنتی

ل پک کردن ستون کروماتوگرافی……………………….69
3-9. آزمون کنترل کیفی کونژوگه………………………………………71
3-9-1. کنترل تب زایی در خرگوش(in vivo test)……………………71
3-9-2. کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal Toxicity)………..72
3-10. واکسیناسیون و سنجش ایمنی زایی کونژوگه……………………..72
3-11. آزمون بررسی فعالیت باکتری کشی سرم حیوان(سرم باکتریسیدال اسیSBA)…………………………………………………………………73
3-11-1. اصول آزمون SBA……………………………………………74
4-1. تعیین میزان LPS خام در نمونه استخراج شده با آزمون نووتنی……77
4-2. تعیین غلظت پروتئین در نمونه Omp بروسلا آبورتوس RB51 به روش لوری…………………………………………………………………….80
4-3. نتایج کنترل کیفی کونژوگه……………………………………….81
4-6. نتایج بررسی کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal toxicity)..82
4-5. نتایج کنترل تب زایی در خرگوش (in vivo test)………………..82
4-7. ارزیابی فعالیت باکتری کشی سرم باکتریوسیدال اسی(SBA)…………..83
فهرست شکل ها
شکل(2-1)- عفونت دریچه قلب توسط B.abortus ……………….12
شکل(2-2)بروسلا آبورتوس دارای منشاء گاوی…………………………………………..21
شکل(2-3) بروسلا سوئیس دارای منشاء خوک……………………………………………..22
شکل(2-4) بروسلا سوئیس دارای منشاء موش صحرایی………………………………….23
شکل(2-5) بروسلا سوئیس دارای منشاء پستانداران دریایی……………………………….24
شکل(3-1) کنترل سوش RB51 با استفاده از اکروفلاوین………………………………..60
شکل (3-2)کشت و درو بروسلا…………………………………………………………….61
شکل(3-3):استخراج LPS به روش فنول داغ اصلاح شده……………………………..62
شکل(3-4) کیسه دیالیز کونژوگه Omp+ LPS…………………………………………69
شکل(3-5): عبور کونژوگه از ستون کروماتوگرافی………………………………..71
فهرست نمودارها و جدول ها
جدول(4-1). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت LPS استاندارد……………………78
نمودار(4-1): نمودار استاندارد غلظت LPS………………………………………………79
جدول(4-2). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت Omp به روش لوری………………80
نمودار(4-2). نمودار استاندارد لوری……………………………………………………81
نمودار(4-3).کروماتو گرافی کونژوگه و فراکشن های آن……………………………..82
جدول(4-3): نتایج گشت رقت های مختلف سرم خرگوش تزریق شده با واکسن کونژوگه و واکسن زنده……………………………………………………………………………..85
چکیده
بروسلوز مهمترین بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با بروسلا به وجود می آید. به خاطر ماندگاری بروسلوز،در دنیا سالیانه500000 نفر به این بیماری مبتلا می شوند.واکسن های مورد استفاده در بروسلوز همچون S19 و RB51 که به صورت زنده هستند، در مواردی منجر به بیماری در دام و یا انسان می شوند. مصونیت علیه بروسلوز نیازمند القای هردو پاسخ ایمنی، به خصوص ایمنی سلولی است بسیاری از آنتی ژنهای پیکره بروسلا به تنهایی خصوصیات کافی برای القای این پاسخ ها را ندارند. بدین لحاظ به نظر می رسد واکسن زیرواحد مؤثر علیه بروسلوز احتمالا ترکیبی از چند جزء آنتی ژنی خواهد بود.سویهRB51یک سویه واکسنی پایدار، خشن غنی از پروتئین غشای خارجی می باشد و مهمترین مزیت واکسیناسیون با این سویه، عدم القای آنتی بادی بر علیه زنجیرهO،LPSمی باشد یعنی ایمنی ایجاد شده بر علیه آن فقط از نوع سلولار می باشد.آنتی ژنهای غشای خارجی از خارجی ترین اجزای پیکره بروسلا هستند که درتماس مستقیم با سیستم ایمنی میزبان قرار دارند. بدین لحاظ به عقیده بسیاری از محققین این آنتی ژنها از اجزای اصلی واکسن های زیر واحد احتمالی خواهند بود.تزریقLPS نیز به تنهایی باعث القای تولید آنتی بادیهای مصونیت زا می گردد ولی سیستم ایمنی سلولی را تحریک نمی کند. این موضوع به دلیل نقشLPSبه عنوان یک آنتی ژن غیر وابسته به تیموس است. بدین لحاظ مصونیت ناشی ازLPSدر مقابل بروسلا، کوتاه مدت و ناقص است.بنابراین در این پروژه هدف آن است که با چسباندنLPSبهOMPواکسن کاملی تهیه گردد که بتواند هم ایمنی هومورال وهم سلولار را تحریک نماید.به این منظور بروسلا آبورتوسS99وRB51در محیط کشت بروسلا آگار کشت می گردد. سپس، سلول های کشت شده باPBSشسته شده و توده سلولی هر کدام جمع آوری می گردد.OMPاز طریق روش سدیم لوریل سارکوزینات از سویهRB51تخلیص می گردد و نیزLPS ، سویهS99از طریق روش فنل داغ اصلاح شده تهیه می گردد. سپس با استفاده از EDAC وآدیپیک اسید دی هیدرازید، لیپوپلی ساکارید بهOMP کونژوگه می گردد و پس از انجام آزمایشات کنترل کیفی، کونژوگه حاصل جهت آزمایشات ایمنی زایی به خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق می گردد و از سرم بدست آمده آزمایشاتSerum Bactericidal Assay به عمل می آید. نتایج حاصله یادداشت و برای تجزیه و تحلیل های آماری به کار گرفته می شوند.
فصل اوّل
کلیات
مقدمه:
بروسلا ها کوکوباسیل های گرم منفی وغیر متحرک اند که انگل اختیاری دورن سلولی می باشند.این باکتری هاعفونت های سیستمیک و خونی در انسان وحیوان ایجاد می کنند(zoonosis).بروسلا بی هوازی اختیاری بوده که کپسول ندارد. این باکتری ها zoonosis بوده که در حیوانات اهلی به صورت منبع اصلی این باکتری ها هستند وانسان ها میزبان های اتفاقی هستند. بروسلا ها در انسان باکتریمی داده ومی توانند برای مدت طولانی در خون انسان باقی بمانند. جنس بروسلا براساس تنوع آنتی ژنی ومیزبان اولیه شامل7گونه ی (بروسلاملیتنسیس) درگوسفندوبز،)بروسلاسوئیس (درخوک)،بروسلاآبورتوس (درگاو،) بروسلااویس (درگوسفند) بروسلاکانیس (درسگ)،،بروسلانئوتومه (درموش جنگلی و) بروسلاماریس (درپستانداران دریایی می باشد.بروسلا در میزبان حیوانی خود بیماری شدیدی ایجاد می کند اماعفونت آنها در انسان ملایم است معمولا.در بیماری بروسلوز انسانی(تب مواج یا تب مالت)دو مرحله وجود دارد یک مرحله حاد که بصورت باکتریمی حاد اتفاق افتاده وبه دنبال آن مرحله مزمن ایجاد می شود که ممکن است سال ها طول کشیده بافت های مختلفی را درگیر می کند. این باکتری ارگان های بسیاری را می تواند درگیر کند. بروسلا آبورتوس از جمله مهم ترین عوامل سقط جنین به گاو است.دلیل ایجاد سقط جنین در گاو علاقه مندی این باکتری به الکل 3کربنه اریتریتول می باشد از آنجا که در منطقه جفت گاو است باکتری در این منطقه کلنیزه می شود.چون انسان اریتریتول ندارد سبب سقط جنین نمی شود. 3 آنتی ژن سطحی در بروسلا شناسایی شده که 2 آنتی ژن توسط فرم S کلنی شده و یک آنتی ژن توسط فرم R کلنی تولید می شود.Ag A که به طور غالب در بروسلا آبورتوس دیده می شود.Ag M به طور غالب در ملی تنسیس دیده می شود. سالانه 500.000 مورد مبتلا به تب مالت به WHO(سازمان جهانی سلامت)گزارش می شود .بیماری تب مالت در انسان به3 شکل حاد، موضعی و مزمن بروز می‌کند. بروسلا ملی تنسیس B. melitansis : منطقه مدیترانه، امریکای لاتین، کشورهای حاشیه خلیج فارس، هند یافت می شود. بروسلا آبورتوس B. abortus : در تمام دنیا وجود دارد. بروسلا سوئیس B. Suis : ایالات متحده، جنوب آمریکا، جنوب شرق آسیا ، در ژاپن ، مرکز اروپا و بخصوص شمال و جنوب امریکا بسیار شایع است. امروزه کنترل بیماری بروسلوز به سه اصل کشتن دام‌های آلوده، پاستوریزه کردن محصولات لبنی و واکسیناسیون استوار است.واکسیناسیون دام‌ها برپایه تلقیح سویه‌های زنده ضعیف شده بروسلا آبورتوس (S19 , 45/20) و بروسلا ملی‌تنسیس (Rev1) است.استفاده از این واکسن‌ها در دام با محدودیت‌هایی همراه است؛ تحریک تولید آنتی‌بادی در دام‌های واکسینه شده که مانع از تفکیک آنها از دام‌های مبتلا می‌گردد، همچنین بروز سقط جنین و ابتلا به بروسلوز در این حیوانات، باعث شده تا تلقیح این واکسن‌ها در دام‌ها با احتیاط انجام گیرد. همچنین واکسن های بروسلوز انسانی بر پایه پیکره کامل باکتری غیر فعال شده و یا سویه‌های زنده تخفیف حدت یافته با دو مشکل اساسی مواجه‌اند: نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری می نمایند و دوم آنکه با واکنش‌های ازدیاد حساسیت‌ ناخواسته همراهند.
یافتن واکسن موثر برای مصون سازی بی خطر برای انسان و دام مبنای تحقیقات گسترده ای شده است.در همین راستا، در سال های اخیر ایمنی زایی با آنتی ژن های مختلفی از گونه های بروسلا به شکل مونووالان،طبیعی،کونژوگه وبا نوترکیب مورد مطالعه وبررسی قرار گرفته است(6،7).استفاده از اجزای مختلف سلول بروسلا(LPS,Omp) که توانایی ایجاد پاسخ ایمنی(همورال وسلولار) را داشته باشد وساخت واکسن های کونژوگه ی از نوع زیر واحدی(subunit) که این مشکلات ذکر شده را نداشته باشد،گامی موثر در پیشبرد این اهداف دارد.(16)
فصل دوم
اهمیت و ضرورت انجام تحقیق
واکسیناسیون اقدام بسیار مهم و با ارزشی است که به وسیله آن با هزینه کم، می توان از ابتلاء به بیماری های عفونی جلوگیری کرد.به منظور پیشگیری از بروز و شیوع بیماری های عفونی ومسری بین انسان و دام ریشه کنی،کنترل و مبارزه بابیماری ها از واکسن استفاده میشود.برای اولین بار ایران در سال 1932 وجود بروسلوز در انسان توسط کارشناسان انسیتوپاستور مشخص گردید.در سال 1962 وجود بروسلا ملی تنسیس در نیشابور به اثبات رسید و در سال 1971 بروسلا سوئیس در حومه حصارک از خوک جداگردید.در ایران اولین گزارش از جداسازی بروسلا آبورتوس از گوسفند به عنوان عامل سقط جنین در آن حیوان ،در س22ال 1982 توسط ذوقی وعبادی ارائه شد.
ایمن سازی بر ضد بروسلوز از حدود سال 1906 توسط واکسن های کشته شده آغاز گردیده ولی به علت اثرات مصونیت زای ناکافی آنها هیچ گونه استفاده گسترده ای از این واکسن ها صورت نگرفته است.از سال 1952 واکسن های زنده در ایاات متحده و شوروی سابق مورد استفاده قرار گرفتند گرچه تاثیر ناچیزی داشتند و واکنش های آلرژیک ایجاد میکردند. معیارهای عینی مفید جهت ارزیابی احتمال وجود بروسلوز، شامل علائم فیزیکی،کشت وتست های سرولوژیک،می باشد و آزمایشات خون طبیعی ، معمولا کمکی به تشخیص نمیکند و حتی گاهی نیز گمراه کننده می باشد.باتوجه به اینکه بیماری بروسلوز یک بیماری خطرناک مشترک بین انسان ودام است اکثر کشور های جهان سعی در ریشه کنی کامل این بیماری دارند و برای رسیدن به این هدف از روش (تست و کشتار) برای دام های آلوده به بیماری و استفاده از واکسن برای پیشگیری ازاین بیماری استفاده میکنند.مبارزه با این بیماری کنترل وریشه کنی آن بدلیل کثرت گونه ای عوامل بیماری زا و لزوم هزینه شدن سرمایه های سنگین اقتصادی همواره در بسیاری از کشور های جهان ، با دشواری ها و مشکلات عدیده مواجه بوده است.
از بین عوامل ویرولانس این میکروارگانیسم، لیپوپلی ساکارید به عنوان عامل ویرولانس اصلی شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی،فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند.لیپوپلی ساکارید به لحاظ