پایان نامه ارشد درباره گروه کنترل

روی آن حدود 35 میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده وسپس 1 میلی لیتر از معرف فولین- سیکالتو افزوده و به خوبی مخلوط گردید . بعد از 3 دقیقه، 3 میلی لیتر از محلول سدیم کربنات 2% افزوده و با آب مقطر به حجم 50 میلی لیتر رسید. محلول‌ها به مدت 2 ساعت در دمای آزمایشگاه نگه داشته شد. در طول این مدت مقداری تکان داده شد تا محلول‌ها کاملاً همگن شوند پس از صفرکردن جذب با محلول شاهد جذب هریک از محلول‌ها بادستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر قرائت شد .
با استفاده از جذب‌های به دست آمده از محلول‌های استاندارد گالیک‌اسید، نمودار جذب- غلظت رسم شد و معادله خط آن محاسبه گردید. با قراردادن مقدار جذب عصاره‌ها در این معادله، مقدار معادل گالیک اسید ترکیب های فنلی گیاه به دست آمد. مقدار کل ترکیب های فنلی هم ارز با وزن گالیک اسید در عصاره گیاه، از طریق معادله خط منحنی کالیبراسیون زیر به صورت محاسباتی قابل تعیین است .
Absorbance = 0012/0 × Gallic acid (µg/mg) 0033/0 +
2-5-3- آزمایش بی‌رنگ شدن بتاکاروتن در حضور لینولئیک‌اسید
الف. برای انجام این آزمایش ابتدا محلولهای زیر تهیه شد.
میزان 250 میلی لیتر آب مقطر در ارلن ریخته و جریان مداومی از گاز اکسیژن به مدت 1 ساعت همراه با اختلاط به داخل آن وارد شد تا از اکسیژن اشباع شود.
مقدار 20 میلی‌گرم از هر یک از نمونهها در 10 میلی لیتر دی متیل سولفوکسید حل گردید.
مقدار 20 میلی‌گرم از شاهد مثبت BHT در 10 میلی لیتر دی متیل سولفوکسید حل گردید.
مقدار 7/5 میلی گرم بتاکاروتن در یک بالن ژوژه 10 میلی لیتر ریخته و با کلروفرم (HPLC grade) به حجم رسانده شد.
مقدار 38/56 میلی گرم لینولئیک اسید در بالن ژوژه 5 میلی لیتر ریخته و با کلروفرم به حجم رسانده شد.
بالن‌اول: مقدار 300 میلی گرم توئین 40 در بالن 250 میلی لیتر و بالن‌دوم : مقدار200 میلی گرم توئین 40 در بالن 250 میلی لیتر دیگر ریخته شد.
ب. تهیه محلولهای نهایی و انجام آزمایش
به بالن اول مقدار 3 میلی لیتر و به بالن دوم مقدار 2 میلی لیتر از محلول شماره 5 اضافه شد.همچنین به بالن اول حاوی توئین مقدار 5/1 میلی لیتر از محلول شماره 4 اضافه شد.
با استفاده از تبخیر کننده دوار حلال کلروفرم موجود در هر دو بالن تبخیر و به بالن اول 150 میلی لیتر و به بالن دوم 100 میلی لیتر از آب مقطر اشباع از اکسیژن اضافه و خوب مخلوط شد.
برای هریک از نمونهها، شاهد مثبت وشاهد منفی 3 عدد لوله آزمایش هرکدام حاوی مقدار 350 میکرولیتر از نمونهها (محلول شماره الف-2)، شاهد مثبت (محلول شماره الف-3) و شاهد منفی (حلال مورد استفاده برای تهیه نمونهها) تهیه گردید. همچنین برای هر یک از نمونهها، شاهد مثبت و شاهد منفی یک لوله آزمایش حاوی مقدار 700 میکرولیتر از نمونهها (محلول شماره 2)، شاهد مثبت (محلول شماره 3) و شاهد منفی (حلال مورد استفاده برای تهیه نمونهها) تهیه شد (محلولهای شاهد). به سری 3 تایی لولهها مقدار 5/2 میلی لیتر از محلول بالن 250 میلی لیتر اول و به سری یک تایی مقدار 5 میلی لیتر از محلول بالن 250 میلی لیتر دوم اضافه گردید.
قبل از افزودن محلول (4-الف) به لوله‌های آزمایش عصاره‌ها و شاهد مثبت، این محلول به لوله‌های شاهد منفی افزوده و پس از 2 ساعت ماندن در دمای 50 درجه سانتی‌گراد، اسپکتروفتومتر (UV-Vis) با سری یکتایی محلول‌های شاهد منفی در طول موج 470 نانومتر صفر و جذب سری سه تایی شاهد منفی در این طول موج سه بار خوانده شد. میانگین جذبها در طول موج نام برده باید بین 4/0 -3/0 به دست آید.
تمامی نمونهها و شاهدهای مثبت و منفی به مدت 2 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد نگه داری شدند. پس از این مدت دستگاه را هر بار با محلولهای موجود در لولههای تکی مربوط به نمونهها، شاهد مثبت و منفی در طول موج 470 نانومتر صفر نموده و جذب مجموعههای سه تایی نمونهها و شاهدهای مثبت و منفی در این طول موج خوانده شد و با استفاده از رابطه ذیل درصد مهار لینولئیک ‌اسید محاسبه ‌گردید.
%I={1- (As (t=0) – As (t=2h))/ (Ac (t=0) – Ac (t=2h)) } ?100
جذب نمونه‌ها در لحظه صفر : As (t=0)
جذب نمونه‌ها پس از 2 ساعت: As (t=2h)
جذب شاهد منفی در لحظه صفر:Ac (t=0)
جذب شاهد منفی پس از 2 ساعت:Ac (t=2h)
درصد مهار :%I
2-6- فعالیت ضدمیکروبی
2-6-1- روش انتشار در آگار (دیسک دیفیوژن)
تعیین فعالیتهای ضدمیکروبی عصارههای گیاهی با روش انتشار در آگار )1997، NCCLS) انجام شد. عصاره خشک گیاه در DMSO با غلظت نهایی 30 میلی گرم بر میلی لیتر حل شده و با فیلتر میلی‌پور 45/0 میکرومتراستریل شد. سپس 100 میکرولیتر از سوسپانسیون حاوی ml/CFU 108 از باکتری ها، CFU/ml 106 از مخمر و spore/ml104 بر روی محیط‌های کشت نوترینت آگار، سابرو دکستروز و پوتیتو دکستروز آگار اسپری شد. دیسک (با قطر6 میلیمتر) با 10 میکرولیتر از محلولهایی از عصاره‌ها آغشته شده (g/discµ300) و DMSO (به عنوان کنترل منفی) در آگار تلقیح شده قرار داده شد. صفحات آغشته شده به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد برای سویه‌های باکتریایی و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت و 72 ساعت برای سویههای مخمر و کپک به صورت جدا در انکوباتور بودند. بر روی هر دیسک 10 میکروگرم از جنتامیسین و 5 میکروگرم از ریفامپین برای باکتری‌ها و I.U.100 نیستاتین برای قارچ به عنوان گروه کنترل مثبت مورد استفاده قرار گرفت. قطرهاله مهار با استفاده از خط‌کش آنتی‌بیوگرام اندازه‌گیری شد و به عنوان معیاری برای فعالیت ضد میکروبی مورد استفاده قرار گرفت. در هر مورد دیسک‌گذاری دو بار تکرار شد.
2-6-2- تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد
در این روش حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) برای میکروارگانیسمهای حساس به عصارههای گیاهی با روش رقت‌سازی در محیط کشت مایع محاسبه گردید. برای این منظور صفحههای 96 خانهای استریل تهیه شد. به هر یک از خانهها 95 میکرولیتر محیط کشت مایع BHI، 5 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی با رقت 5/0 مک فارلند و 100 میکرولیتر از غلظتهای مختلف عصاره (500-8/7 میکرو گرم بر میلی لیتر) افزوده شد و سپس در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گذاشته شد. رشد میکروبی با حضور کدورت در ته‌چاهک مشخص میشود. مقدار MIC کمترین غلظت عصاره مورد نیاز برای مهار رشد هر میکروارگانیسم تعریف می‌شود.
2-7- آزمون سمیت سلولی
تخم‌های آرتمیا سالینا (Artemia salina)، برای باز شدن در آب شور مصنوعی دریا در آکواریوم تحت نور و هوادهی مداوم و دمای 30 درجه سانتی‌گراد بن ماری، برای 48 ساعت قرار داده شدند. آب شورمصنوعی از انحلال نمک‌های زیر در 2 لیتر آب مقطر حاصل شد.
g) 22) H2O6MgCl2.، (g 8 ) Na2SO4، g)6/2) H2O2CaCl2.، g)4/1)KCl، (g46)NaCl
pH آب شور برابر 9 تنظیم شد که در صورت کم بودن pH از سدیم کربنات برای بالا بردن آن استفاده می‌شود. لاروهای با استفاده از ویژگی فوتوتروپی از پوسته‌ها و تخمهای تفریخ نشده جدا شدند. مقدار 05/0 گرم از عصاره در 8/0 میلی‌لیتر DMSO حل شده و با آب شور به حجم 25 رسید. برای اطمینان از خنثی بودن اثر حلال بر روی لاروها، شاهد DMSO هم مورد آزمایش قرار گرفت. به هر لوله آزمایش 10 لارو آرتمیا اضافه شد (برای جدا کردن‌لاروها از پیپت پاستور استفاده شد) و رقتهایی از محلول‌های استوک ‌نمونههای گیاهی (10، 300، 500، 700، 1000 میکروگرم بر میلی لیتر) در لولههای آزمایش تهیه نموده و حجم آنها با آب دریا به 5 میلی لیتر رسید. در لولههای آزمایش کنترل منفی آب دریا و حلال DMSO به تنهایی اضافه شد. و لوله‌های آزمایش در بن‌ماری با دمای 30 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت بعد از 24 ساعت تعداد لاروهای مرده در لوله آزمایش بررسی شد. از روی شمارش لاروهای مرده درصد مرگ‌ومیر و نمودار غلظت-درصدکشندگی حاصل می‌شود و 55 LC50 (غلظتی که درصد کشندگی 50 را دارد) قابل محاسبه است.
فصل سوم
نتایج، بحث و نتیجهگیری
مقدمه
پس از آماده‌سازی گیاه جمع آوری شده از مناطق اطراف بروجن، با دستگاه SDE ترکیبات فرار آن و با سوکسله عصاره غیرفرار استخراج شد که نتایج مربوط در جدول‌های 3-1 و 3-4 گزارش شده است. سپس تجزیه و تحلیل ترکیبات فرار استخراجی با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی-طیف نگار جرمی، محاسبه زمان بازداری کواتس در طیف GC-MS و مقایسه طیف‌های جرمی نمونه با طیف‌های جرمی استاندارد صورت گرفت و ترکیب‌های فرار مشخص گردید. در ادامه کار، اثرات ضد اکسیدانی، ضدمیکروبی، محتوای تام فنلی و سمیت سلولی با استفاده روش‌های مشروح در فصل دوم ارزیابی شد و نتایج در این فصل گزارش شده است.
3-1- ترکیبات ‌فرار گیاهی
3-1-1- استخراج ترکیبات ‌فرار گیاهی
در این پژوهش استخراج اسانس از گیاهان مذکور با دستگاه SDE در حضور حلال آلی انجام گرفت . نتایج و بازده اسانس گیری در جدول ذیل نشان داده شده است.
جدول 3-1: مقایسه بازده استخراج ترکیبات فرار

دیدگاهتان را بنویسید